顺铂通过 LOX-1/p38/NF-κB 信号通路诱导生长板功能障碍

本文揭示顺铂会诱导生长板功能障碍，其机制与 LOX-1/p38/NF-κB 信号通路有关，为相关研究提供思路。

　　

顺铂对儿童癌症治疗及生长板的影响

在儿童癌症的治疗中，多种抗癌药物虽能诱导癌细胞程序性死亡，显著提高患儿生存率，但也带来诸多长期不良反应。顺铂（Cisplatin）作为一种广泛应用于儿科癌症化疗方案的强效抗癌药物，对治疗多种儿童恶性肿瘤如生殖细胞肿瘤、视网膜母细胞瘤、脑肿瘤等至关重要。然而，它在发挥抗癌作用的同时，却对儿童的生长发育产生了不良影响。

研究发现，顺铂会阻碍生长板软骨细胞的增殖，使生长板增殖层高度降低，进而影响骨骼生长。其具体表现为，顺铂可能引发低镁血症，抑制成骨细胞和破骨细胞的活性，间接阻碍骨骼生长；同时，顺铂还能直接抑制软骨细胞的增殖，打乱生长板的正常结构和功能。但长期以来，顺铂导致生长板功能障碍的确切分子机制一直是个谜，这也成为了相关领域研究的重点和难点。

研究涉及的关键分子及信号通路

1. LOX-1 的潜在作用：凝集素样氧化低密度脂蛋白受体 - 1（LOX-1）在多种疾病的发展过程中扮演着重要角色，如骨关节炎和动脉粥样硬化。在软骨平衡的调节中，LOX-1 也起着关键作用。已有研究表明，在其他细胞环境下，阻断 LOX-1 能够减轻氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）处理诱导的软骨细胞损伤和氧化应激。然而，在顺铂介导的软骨细胞损伤过程中，LOX-1 的具体作用却尚不明确，这也为本次研究提供了一个关键切入点。
2. 氧化应激与 MAPK 通路：顺铂诱导细胞死亡的一个重要机制是促进自由基尤其是活性氧（ROS）的生成。同时，顺铂还会触发丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化，其中 p38 和细胞外信号调节激酶（ERK）是 MAPK 通路中的关键成员。当细胞受到顺铂刺激时，ROS 浓度会升高，进而激活 MAPK 通路，导致 p38 和 ERK 磷酸化水平上升。这种变化会进一步影响细胞的功能和命运，可能导致细胞损伤、炎症反应以及凋亡等一系列不良后果。
3. NF-κB 的激活与炎症反应：核因子 κB（NF-κB）是一种在炎症、免疫、细胞增殖和细胞存活等多种生物学过程中发挥重要调控作用的转录因子。顺铂处理会促进氧化应激，而氧化应激会进一步激活 NF-κB 信号通路。在这个过程中，ROS 的积累不仅会造成细胞损伤，还会激活 NF-κB，从而引发炎症反应。NF-κB 的激活会导致一系列炎症相关基因的表达上调，进一步加剧细胞的损伤和功能障碍，形成一个恶性循环，对软骨细胞的正常功能产生严重影响。

实验材料与方法

1. 细胞培养：本研究选用 TC28a2 人软骨细胞进行实验，这些细胞来自 Millipore Sigma 公司。在培养过程中，使用含有青霉素 - 链霉素以及 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）/F-12 培养基。实验中用到的多种试剂，如 FBS、胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸、LY3214996、SB203580、PDTC 等，均购自 Millipore Sigma 公司；而辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗则来自 Cell Signaling Technology 公司。在实验处理时，将软骨细胞以 1×10⁶的密度接种于 6 厘米直径的培养皿中，在 CO₂培养箱中培养 36 小时后，用 1×PBS 洗涤细胞，然后用 10 μM 顺铂在复合培养基中处理 24 小时。部分细胞在接触顺铂前，会先用 5 μM N - 乙酰半胱氨酸（NAC）预处理 2 小时。
2. 检测方法
   • 蛋白质检测（Western blot assay）：细胞裂解时，使用添加了多种磷酸酶抑制剂（NaF 和 Na₃VO₄ ，浓度均为 1 mM）和蛋白酶抑制剂（亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂 A、抑肽酶、4 - （2 - 氨基乙基）苯磺酰氟，浓度分别为 10 μg/mL、10 μg/mL、10 μg/mL、1 mM）的放射免疫沉淀裂解缓冲液。裂解后，将蛋白质与 Bio-Rad Laboratories 的电泳样品缓冲液混合，煮沸 5 分钟，然后进行十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质。分离后的蛋白质转移到 Millipore 硝酸纤维素膜上，依次与 Cell Signaling Technology 公司的一抗（针对磷酸化 p38、p-ERK、NF-κBp65、IκBα、LOX-1、Bcl-2、Bax、细胞色素 c、β- 肌动蛋白和 Lamin B1）和二抗孵育，通过检测蛋白质的表达水平来分析相关信号通路的变化。
   • ROS 水平检测（ROS assay）：采用 DCFH-DA 染色试剂盒（Beyotime Biotechnology）检测细胞内 ROS 水平。将细胞接种于培养皿中，按照实验方案，用含有 DCFH-DA（比例为 1000:1）的基础培养基孵育 30 分钟。之后，利用 Olympus 公司的荧光显微镜随机拍摄样品视野，通过多功能荧光酶标仪在 490/520 nm 处检测相对荧光单位（RFU）值，以此来反映细胞内 ROS 的水平变化。
   • 细胞凋亡检测（TUNEL assay）：运用原位末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的 dUTP 缺口末端标记（TUNEL）实验来检测软骨细胞的凋亡情况。首先将细胞用丙酮固定，然后在 4°C 下用通透缓冲液处理 5 分钟，接着用 0.3% H₂O₂/ 甲醇进行封闭，再在 37°C 下用 50 μL TdT 标记溶液孵育 90 分钟。随后进行洗涤，室温下用生物素化的抗 FITC 抗体孵育 30 分钟，最后用 0.025% DAB/PBS 显色，并用甲基绿复染。在每张载玻片上随机选取 4 个视野，在 200× 放大倍数下计算 TUNEL 阳性细胞的百分比，从而评估细胞凋亡程度。
   • 统计分析：实验数据以平均值 ± 标准差（SD）表示。对于不同处理组的细胞数据，采用单因素方差分析（ANOVA），并进行 Tukey 事后检验。使用 OriginLab2020 软件绘制图表，当 p < 0.05 时，认为差异具有统计学意义。

实验结果

1. 顺铂增加 TC28a2 细胞内 ROS 生成：研究结果显示，用不同浓度（2.5 - 10 μM）的顺铂处理 TC28a2 细胞 24 小时后，细胞内 ROS 水平呈现出剂量依赖性增加的趋势。其中，5 μM 和 10 μM 顺铂处理组的 ROS 水平显著高于对照组，这表明顺铂能够明显促进细胞内 ROS 的产生，引发氧化应激反应。
2. 顺铂通过增加氧化应激激活 ERK/p38 MAPK 通路：通过 Western blotting 检测发现，随着顺铂浓度的增加，p-ERK:p-p38 的比值呈现出浓度依赖性上升。而当使用抗氧化剂 NAC 预处理细胞后，p-ERK 和 p-p38 的表达水平明显降低。这一结果表明，顺铂是通过增加细胞内的氧化应激来激活 ERK/p38 MAPK 通路的，氧化应激在顺铂诱导的细胞信号通路变化中起着重要的介导作用。
3. 调节 ERK 和 p38 信号通路可减轻顺铂诱导的炎症反应：进一步研究发现，顺铂处理会导致软骨细胞中 NF-κBp65 的磷酸化水平升高，同时 IκBα 的表达水平降低，这表明顺铂激活了 NF-κB 信号通路。而当使用 ERK 和 p38 抑制剂（LY3214996 和 SB203580）处理细胞后，NF-κBp65 的水平下降，IκBα 的水平上升。由此可以推断，顺铂是通过调节 ERK/p38 MAPK 信号通路来诱导软骨细胞中 NF-κB 的激活，进而引发炎症反应，抑制这一信号通路则可以减轻炎症反应。
4. 顺铂上调 LOX-1 表达：当 TC28a2 细胞暴露于顺铂后，再用 ERK、p38、NF-κB 抑制剂（LY3214996、SB203580 和 PDTC）以及 NAC 处理，发现顺铂处理组的 LOX-1 mRNA 和蛋白质表达水平均显著高于对照组。而且，这些抑制剂和 NAC 能够显著降低顺铂引起的 LOX-1 表达上调。这说明顺铂是通过调节 ROS 介导的 ERK/p38 MAPK/NF-κB 信号通路来上调 LOX-1 表达的，LOX-1 的表达变化与顺铂诱导的多条信号通路密切相关。
5. 顺铂通过 ROS 介导的 LOX-1 通路诱导 TC28a2 细胞凋亡：Western blotting 检测结果表明，顺铂处理会使软骨细胞中 Bcl-2 的蛋白质水平显著降低，而 Bax 和胞质细胞色素 c 的蛋白质水平显著升高。使用 ERK 和 p-38 抑制剂（LY3214996 和 SB203580）处理后，胞质细胞色素 c 和 Bax 的蛋白质水平明显低于顺铂处理组。此外，通过 caspase 3 活性检测和 TUNEL 实验进一步证实，LY3214996、SB203580、PDTC 抑制剂以及 NAC 和 LOX-1 基因沉默均能减轻顺铂诱导的细胞凋亡。这一系列结果表明，顺铂是通过 ROS 介导的 LOX-1 通路诱导 TC28a2 细胞凋亡的，LOX-1 在顺铂诱导的细胞凋亡过程中起着关键作用。

研究讨论

1. 顺铂影响生长板的机制探讨：越来越多的研究表明，儿童癌症治疗中的多种药物和联合用药都可能诱导软骨细胞凋亡和生长板功能障碍，从而影响患儿的生长发育。在本研究中，发现顺铂会通过激活软骨细胞中的 LOX-1，增加氧化应激，进而触发炎症和凋亡反应。顺铂能够抑制生长板软骨细胞的增殖，使生长板的增殖层高度降低，影响纵向生长，但具体的损伤机制此前并不清楚。通过本次研究，初步揭示了顺铂诱导 ROS 产生及其相关信号通路的变化，为深入理解顺铂影响生长板功能的机制提供了重要线索。
2. 信号通路间的相互作用：软骨细胞的分化和 LOX-1 的表达受到多种信号通路的调控，包括 MAPKs（如 p38 和 ERK）、磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）/Akt 以及 c-Jun N - 末端激酶等，这些通路通过影响 ROS 的产生来发挥作用。在本研究中，发现顺铂暴露产生的 ROS 会调节 ERK/p38/MAPK 信号通路，进而导致更多的 ROS 生成、细胞凋亡和炎症反应。p38 MAPK 通路在软骨细胞中参与多种基质金属蛋白酶（MMPs）和炎症介质的生成，同时还能诱导氧化应激和 LOX-1 的表达。而 ERK 通路则对多种刺激产生响应，与细胞的增殖、分化等过程密切相关。这些信号通路之间相互交织，共同影响着软骨细胞在顺铂作用下的命运。
3. LOX-1 在细胞凋亡中的关键作用：在其他细胞研究中发现，LOX-1 与 Ox-LDL 结合会触发 ROS 产生，进而导致细胞死亡。在本研究中，顺铂诱导的 LOX-1 过表达可以通过多种抑制剂和 NAC 处理得到抑制，这表明 ERK/p38MAPK 通路对 LOX-1 的调控在软骨细胞凋亡过程中起着重要作用。此外，Ox-LDL 通过 LOX-1 激活 caspase-3，引发细胞凋亡，这一过程与 Bcl-2 等抗凋亡蛋白的表达降低以及促凋亡蛋白的释放有关。这些研究结果进一步证实了 LOX-1 在顺铂诱导的软骨细胞凋亡过程中的关键地位。
4. 研究的局限性与展望：本研究虽然取得了一定的成果，但也存在一些局限性。首先，研究仅在细胞水平进行，没有进行动物实验来进一步验证研究结果，这使得研究结论在体内环境中的适用性存在一定的不确定性。其次，研究未进行免疫荧光染色，无法直观地观察蛋白质的定位和表达情况。然而，目前的实验结果已经能够为相关研究提供有力的支持。未来的研究可以考虑开展动物实验，结合免疫荧光等技术，进一步深入探究顺铂诱导生长板功能障碍的机制，为临床治疗提供更可靠的理论依据。
5. 研究结论与潜在治疗策略：综合本研究结果，顺铂在癌症治疗过程中会引发细胞损伤，包括 ROS 生成、促炎反应和细胞凋亡等一系列不良后果。研究发现，顺铂通过 LOX-1/ROS/p38/NF-κB 信号通路诱导 TC28a2 细胞凋亡，其中 LOX-1 在这一信号通路的起始阶段起着至关重要的作用。基于这些发现，抑制 LOX-1 可能成为减轻炎症诱导的软骨损伤的一种有前景的治疗策略，为解决儿童癌症治疗中顺铂引发的生长板功能障碍问题提供了新的思路和方向。