利用核糖体表型快速分类大肠杆菌抗生素敏感性和耐药性菌株

为应对抗菌药物耐药性（AMR），研究人员用核糖体靶向探针和卷积神经网络（CNN）研究大肠杆菌，可快速分类菌株，意义重大。

　　在如今的医疗领域，细菌感染就像一群来势汹汹的 “小怪兽”，给人类健康带来了极大的威胁。2019 年，细菌感染导致了全球 14% 的死亡，在败血症相关死亡中更是占了大头。而抗生素，原本是对抗细菌的 “神奇武器”，但由于在医疗和农业中的广泛使用，细菌逐渐产生了耐药性，这一现象被称为抗菌药物耐药性（AMR）。2019 年，全球有 127 万人直接死于细菌的 AMR，还有 495 万人的死亡与之相关。要是不采取措施，到 2050 年，每年因 AMR 死亡的人数预计将飙升至 1000 万。这就好比细菌穿上了越来越坚固的 “铠甲”，让抗生素的威力大打折扣。

面对这样严峻的形势，抗生素敏感性测试（ASTs）就显得尤为重要。它能帮助医生精准选择合适的抗生素，避免滥用。然而，目前大多数临床微生物检测流程中，ASTs 往往要在细菌病原体培养和鉴定之后进行，对于常见菌种，结果需要 12 - 48 小时才能出来。在一些危及生命的感染中，这个等待时间实在是太长了，医生们等不及，只能凭经验用药，或者使用广谱抗生素。但这又会进一步加剧 AMR 问题，就像陷入了一个恶性循环。所以，开发快速的 ASTs 技术迫在眉睫。

为了解决这些难题，来自英国牛津大学等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Communications Biology》上。研究人员利用核糖体靶向的荧光原位杂交（FISH）探针，结合卷积神经网络（CNN），来检测大肠杆菌细胞内与抗生素敏感性相关的变化，从而实现对大肠杆菌抗生素敏感性和耐药性菌株的快速分类。

在研究方法上，主要用到了以下几种关键技术：一是利用特定的 FISH 探针标记核糖体，这些探针能与核糖体特异性结合，方便后续观察；二是通过荧光显微镜对标记后的细胞进行成像，获取细胞的图像信息；三是运用 CNN 对这些图像进行分析和分类，CNN 就像是一个 “智能大脑”，能从图像中学习和识别不同的核糖体表型。研究人员使用的细菌样本包括实验室菌株大肠杆菌 MG1655，以及从血液感染中分离出的 6 种临床菌株。

研究结果如下：

• 大肠杆菌抗生素反应的核糖体亚细胞分布特征：研究人员用 4 种作用机制不同的抗生素（环丙沙星、庆大霉素、氯霉素和羧苄青霉素）分别处理抗生素敏感的大肠杆菌 MG1655 30 分钟，然后用荧光 FISH 探针染色。结果发现，不同抗生素处理后，细胞内的核糖体分布出现了明显的特征性变化，而且这些变化与 DNA 和核糖体密度的反相关性在处理前后都能观察到。例如，氯霉素、环丙沙星和庆大霉素会导致类核（细菌中相当于细胞核的区域）压实，羧苄青霉素会使细胞丝状化且出现多个 DNA 区域和较低的核糖体强度。同时，研究还确定了不同抗生素诱导表型变化的最佳浓度，为后续研究提供了重要的基准12。
• 神经网络准确识别抗生素敏感的核糖体表型：研究人员对荧光图像进行预处理，包括用自定义的 CellPose 模型进行细胞分割、图像整理和增强等操作，然后用这些图像训练 CNN。通过旋转留出测试法，他们发现训练好的 CNN 能以极高的准确率识别出经抗生素处理后的核糖体表型，对不同抗生素处理的细胞分类平均平衡准确率都超过 95%，其中环丙沙星约为 99%，庆大霉素约为 98%，氯霉素约为 95%，羧苄青霉素约为 99%34。
• 核糖体表型可用于分类环丙沙星耐药的临床大肠杆菌分离株：研究人员选取了 3 种对环丙沙星敏感和 3 种耐药的临床大肠杆菌菌株，用环丙沙星处理后观察其核糖体表型。敏感菌株的核糖体表型与处理后的 MG1655 相似，而耐药菌株多数呈现出不同的表型，细胞伸长但类核区域分散。用基于 MG1655 训练的 CNN 对临床分离株进行分类时，准确率不太理想。于是，研究人员用临床分离株的图像训练新的 CNN，新模型对未知的临床分离株细胞分类准确率大大提高，单细胞平衡准确率达到 95.0 ± 0.3%，对耐药细胞分类准确率为 99.3 ± 0.2%，对敏感细胞分类准确率为 90.5 ± 0.5%，而且仅需检测 2 个细胞就能以 99% 的置信度区分敏感和耐药样本56。
• 核糖体表型可用于分类未见菌株和抗生素浓度：研究人员用 1×EUCAST 环丙沙星处理 1 种敏感菌株（S2）和 1 种耐药菌株（R4），并以此训练模型，然后用该模型对 6 种临床分离株在 20×EUCAST 环丙沙星处理后的细胞进行分类。结果显示，虽然该模型准确率低于六菌株模型，但仍能以较高准确率区分敏感和耐药细胞，这表明核糖体表型分类方法具有一定的稳健性，只要模型有足够相似的训练数据，就能对不同浓度处理的未见菌株进行可靠分类78。
• 同时识别细菌种类和核糖体表型：研究人员使用针对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的物种特异性 FISH 探针，在混合样本中成功区分了这两种细菌，并且用 CNN 对大肠杆菌细胞进行分类时，识别为环丙沙星处理后的准确率达到 97.1%。这说明核糖体表型分析可以与物种特异性 FISH 探针结合，从同一图像数据集中识别细菌种类和抗生素表型910。

研究结论和讨论部分指出，这项研究证明了核糖体靶向的 FISH 探针可用于可视化大肠杆菌细胞内的抗生素反应表型，这些表型能为单细胞 ASTs 提供数据。虽然临床分离株的抗生素反应更为复杂，但通过训练针对临床分离株的模型，能实现较高的分类准确率。而且该方法对未在训练数据中出现的临床菌株和不同抗生素浓度处理的菌株也有一定的分类能力。如果将其应用于实际的 ASTs 检测，随着 CNN 模型获取更多临床数据，其性能有望进一步提升。不过，该方法也存在一些局限性，比如只能在固定时间点评估核糖体表型，检测每种抗生素都需要单独进行，且需要显微镜平台和样本制备方法。但它在深度学习辅助药物发现和研究抗生素作用机制等方面具有很大的潜力。

总的来说，这项研究为快速准确地进行抗生素敏感性测试提供了一种新的方法和思路，在生命科学和健康医学领域具有重要的意义，有望为解决抗菌药物耐药性问题带来新的突破。