《Nature Methods》开启细胞器研究的新视角，解锁细胞奥秘的有力工具

为解决细胞器形态和运动量化难题，Calico Life Sciences LLC 的研究人员开展 Nellie 相关研究，开发出自动化分析工具，助力细胞生物学研究。

　　

在细胞的微观世界里，细胞器就像一个个忙碌的 “小工厂”，它们持续进行着形态变化和动态相互作用，这些活动对于细胞维持内环境稳定、应对外界压力以及疾病的发展进程都有着至关重要的影响。打个比方，线粒体作为细胞的 “能量工厂”，其动态变化的平衡调控着自身的更新、质量控制、线粒体 DNA 的组织以及生物能量的产出 。同时，细胞器之间还会形成接触位点，就像一个个 “物资交换站”，便于代谢物、离子和蛋白质的交换，促进自噬周转，一旦这些过程出现异常，就可能与衰老和多种疾病挂上钩。

然而，想要深入了解这些细胞器的奥秘并非易事。由于细胞器结构复杂、运动迅速，再加上显微镜技术存在诸如采集速度、衍射极限以及信号与光毒性之间的权衡等限制，提取相关信息困难重重。目前，现有的分析方法要不就是依赖人工操作，不仅耗时费力，还容易受到主观因素的干扰；要不就是针对特定细胞器的分析流程，无法广泛适用于更多的数据集。在这个背景下，开发一种能够广泛应用、自动化程度高且不受用户和细胞器类型限制的分析工具就显得尤为迫切。

为了攻克这些难题，来自 Calico Life Sciences LLC 的 Austin E. Y. T. Lefebvre 等人展开了深入研究 。他们的研究成果 ——Nellie（organellometer 的缩写），为细胞生物学研究带来了新的曙光。这项研究成果意义非凡，它为科学家们提供了一种强大的工具，有助于更深入地探究细胞内的组织和动态变化，推动细胞生物学领域的发展。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。在图像预处理阶段，他们采用了改进的多尺度 Frangi 滤波器，这种滤波器能够根据图像元数据自动调整，增强细胞器的结构对比度，为后续的分割工作奠定基础。在分割和跟踪方面，Nellie 通过一系列复杂的算法，如基于 Minotri 阈值的语义分割、连通组件标记、骨架化处理等，实现了对细胞器的多层次分割和精确跟踪。同时，为了提取更丰富的特征信息，Nellie 还运用了多种量化技术，从单像素到整个细胞器层面，计算各种空间和时间特征。

下面来详细看看研究的具体成果：

1. 多尺度自适应滤波器增强结构特征：激光和染料的特性会使细胞器的信噪比在不同数据集之间和内部大幅波动。研究人员通过实施改进版的多尺度 Frangi 滤波器，有效增强了细胞器的固有结构对比度，使分割能够基于局部结构而非荧光强度进行。这种滤波器经过优化，可适应不同大小的细胞器，并能自动调整有效范围。在多种模拟数据集的分割任务中，Nellie 均超越了当前最先进的方法，并且在不同显微镜和细胞器的数据集上也表现出良好的通用性。

2. 分层解构实现多层次分割：研究人员将细胞器看作是一个复杂的层次化结构，通过一系列步骤对细胞器景观进行解构。首先利用 Minotri 阈值生成语义分割掩模，接着进行连通组件标记得到单个细胞器的实例分割，然后对分割结果进行骨架化处理，识别网络连接节点，将细胞器网络解构为各个分支，最后进一步将分支分解为单个骨架节点。通过这种分层解构，Nellie 能够实现对细胞器的多层次分割，为后续的分析提供更详细的信息。

3. 生成运动捕捉标记用于下游跟踪：由于基于对象的分割和骨架网络在不同时间点的一致性较差，会导致跟踪时出现链接问题。为此，研究人员在细胞器内生成运动捕捉（mocap）标记，这些标记独立于标签，作为链接不同时间帧中可变半径区域的基础。使用这些 mocap 标记生成的跟踪轨迹，Nellie 在各种数据集上表现出色，在模拟数据集的跟踪任务中超越了当前的先进方法。

4. 通过可变范围查询收集每个运动捕捉标记的特征：为了在时间上链接这些 mocap 标记，研究人员构建了一个综合特征向量。在每个 mocap 标记处，计算距离变换值、原始图像和预处理图像的均值和方差（统计向量），以及原始强度图像和预处理图像的 Hu 矩不变量（Hu 向量）。通过这些特征构建多方面的成本矩阵，实现标记之间的链接。

5. 跟踪 mocap 标记引导流插值：研究人员采用了一种独特的跟踪和插值方法，即通过将帧 T 的标记分配给帧 T+1 中最佳匹配的标记，实现 1 对 1、1 对多和多对 1 的匹配。基于这些分配结果，通过 k-d 树和距离加权、成本加权的向量求和，对感兴趣坐标的流向量进行插值，从而实现对细胞器亚体素坐标的跟踪。这种方法不仅适用于细胞器，还可应用于其他类型的图像。

6. 跨多个层次计算特征：Nellie 能够在分割层次的每个级别计算并导出大量特征，包括单像素级别的荧光和结构强度值、单节点级别的局部形态和体素流模式、单分支级别的骨架和分支特定形态特征以及单细胞器级别的整体形态特征。同时，Nellie 还能输出最终的聚合数据集，便于对整个细胞器景观进行统计分析，并且可以将这些特征值以颜色映射的方式叠加显示，方便数据探索和可视化。

7. 案例 1：单通道中分离多种细胞器：在细胞显微镜成像中，在单个时间序列中对多种细胞器进行成像面临诸多挑战。研究人员利用 Nellie 的高级特征提取能力和机器学习分类技术，实现了单通道图像中细胞器的事后分离。他们通过多通道时间推移荧光显微镜分别捕获高尔基体和线粒体的图像，提取细胞器特异性特征，训练随机森林分类器。在 11 折交叉验证中，所有模型的表现均优于随机猜测，综合模型的平均受试者工作特征曲线下面积（AUC）达到 0.80，证明了该方法的有效性。

8. 案例 2：细胞器图的表示学习：为了分析细胞器网络的动态变化，研究人员引入了一种新方法。他们将细胞器分割掩模的骨架化网络转换为图结构，利用基于注意力的图自动编码器将 Nellie 的特征输出转换为可比的表示。以线粒体网络为例，在离子霉素处理细胞的实验中，通过比较图节点的潜在空间嵌入，研究人员发现了线粒体网络对离子霉素处理的响应模式，包括内在特征振荡和处理后的恢复动态等。这一案例建立了首个基于细胞器的图自动编码器，为后续的研究提供了新的思路和方法。

9. 案例 3：内质网特征和网络拓扑的表征：研究人员利用 Nellie 分析了原代人成纤维细胞（hFB）中内质网（ER）网络的 3D 光片体积数据。通过 Nellie 的分割算法，他们分离出最大的连通网络组件，并构建图表示，研究 ER 网络的拓扑结构。通过比较 hFB 细胞和 U2OS 细胞系中 ER 网络的拓扑结构、分支形态和运动性，研究人员发现不同细胞系之间存在显著差异，而同一细胞系在不同时间帧之间则相对稳定。通过张量分解和随机森林分类等技术，进一步验证了这些差异，为深入理解 ER 网络在不同细胞中的组织和功能提供了依据。

综合研究结论和讨论部分，Nellie 是一种高效且无偏的分析流程，能够准确自动地分析细胞器的空间和时间特征，并且对各种细胞器和亚结构都具有通用性。它通过多种创新技术，实现了从亚体素到图像层面的多层次分析，为细胞生物学研究提供了丰富的信息。尽管 Nellie 在某些特定细胞器的分析上可能不如专门的软件，但它的优势在于无需参数调整和注释数据集，具有广泛的适用性。随着深度学习的发展，虽然未来可能会出现更强大的通用基础模型，但目前 Nellie 依然是研究人员进行空间和时间分析的有力工具。研究人员计划进一步开发更多插件，扩展 Nellie 对特定细胞器的分析功能，并融入多通道分析工具，以更好地研究细胞器之间的相互作用。Nellie 的出现，有望推动基于成像的细胞器分析方法的发展，促进开放科学的进步，让科学家们能够更深入地理解细胞的奥秘，为生命科学和健康医学领域的研究开辟新的道路。