HIV-1 研究新突破：揭秘 CypA 与 CPSF6 对病毒复制的调控机制

本文揭示 HIV-1 衣壳与宿主蛋白 CypA、CPSF6 相互作用，影响病毒核输入、整合和感染，为抗逆转录病毒疗法提供思路。

　　

一、引言

人类免疫缺陷病毒 1 型（HIV-1）严重威胁全球公共健康。HIV-1 衣壳由衣壳蛋白（CA）单体组装而成，在病毒感染过程中起着至关重要的作用。它不仅保护病毒基因组免受宿主先天免疫因子的识别，还参与病毒基因组向细胞核的运输、逆转录以及病毒 DNA 整合到宿主基因组等多个关键步骤 。正因如此，HIV-1 衣壳成为抗逆转录病毒治疗的重要靶点，首个靶向 HIV-1 衣壳的药物 Lenacapavir（LEN）已获批用于人体治疗。

在 HIV-1 感染过程中，衣壳与多种宿主蛋白相互作用，这些相互作用精确调控着病毒的复制进程。其中，Cyclophilin A（CypA）和裂解和聚腺苷酸化特异性因子 6（CPSF6）是与衣壳相互作用的关键宿主蛋白。CypA 是一种细胞肽酰脯氨酰异构酶，参与蛋白质折叠和运输，它与 HIV-1 CA 结合，在促进早期 HIV-1 复制的同时，还能阻止限制因子 TRIM5α 与衣壳结合 。而 CPSF6 定位于细胞核，作为前体 mRNA 可变聚腺苷酸化因子，它直接与 HIV-1 衣壳结合，促进衣壳解聚、核输入以及病毒 DNA 整合到基因密集的染色质和核斑点相关区域（SPADs） 。

此前研究虽已对这些宿主蛋白与衣壳的相互作用有所了解，但仍存在诸多未知。例如，CypA 和 CPSF6 与衣壳结合的时空动力学以及这些相互作用对 HIV-1 复制的具体影响尚未完全明确。本研究旨在利用 CA 突变体和小分子抑制剂，深入探究 CypA 和 CPSF6 与衣壳结合的时空关系，以及它们对 HIV-1 复制的影响机制，为抗逆转录病毒疗法的发展提供更坚实的理论基础。

二、研究结果

（一）HIV-1_AC-1与 TRIMCyp 的结合特性

研究人员构建了携带五个氨基酸替换的 HIV-1_AC-1突变体，这些替换位于 CA 的 CypA 结合环内，旨在增加 CypA 与衣壳的结合亲和力。通过共沉淀实验，研究人员发现，在成熟衣壳晶格存在的情况下，CypA 与 AC-1 衣壳底物的结合亲和力并未如预期般高于野生型（WT）HIV-1。然而，在感染猫头鹰猴肾（OMK）细胞的实验中，结果却截然不同。OMK 细胞表达 TRIMCyp，它是 TRIM5α 和 CypA 的天然融合蛋白，可通过 CypA 与衣壳的结合限制 HIV-1 感染。实验显示，增加病毒感染复数能克服 TRIMCyp 对 WT HIV-1 的限制，但对 HIV-1_AC-1感染的限制却无法通过增加感染复数来克服。这表明，在感染细胞的环境中，TRIMCyp 的 CypA 结构域与 HIV-1_AC-1的结合亲和力显著高于 WT HIV-1。

（二）CypA 与 CPSF6 对 HIV-1 感染的影响

研究发现，用环孢菌素 A（CsA）处理细胞或降低靶细胞中 CypA 的表达，可使 HIV-1_AC-1的感染性恢复到接近 WT 水平。在缺乏编码 CypA 的PPIA基因的 Jurkat 细胞（PPIA^?/?）中，WT HIV-1 和 HIV-1_AC-1的感染水平相似，且不受 CsA 处理的影响，这进一步证实了 CypA 结合会导致 HIV-1_AC-1感染受限。

此外，研究人员还发现，CA 的 N74D 突变可消除 HIV-1 衣壳与 CPSF6 的结合，但不影响与 CypA 的结合。在多种细胞类型中，N74D HIV-1 和 N74D HIV-1_AC-1的感染情况无差异，这表明 CPSF6 结合也参与了 HIV-1_AC-1感染受限的过程。同时，研究显示，CypA 与 HIV-1_AC-1衣壳的结合能像 WT 衣壳一样防止 TRIM5α 的限制，这意味着 HIV-1_AC-1在抵抗 TRIM5α 限制方面与 WT HIV-1 具有相似的机制。

（三）HIV-1_AC-1衣壳稳定性

为了探究 HIV-1_AC-1衣壳的稳定性，研究人员使用了体外 CA 保留实验。结果显示，HIV-1_AC-1的 CA 保留情况与 WT HIV-1 相似，这表明它们的固有稳定性相近。同时，研究人员在细胞中进一步研究了衣壳稳定性以及 CypA 结合对感染的影响。在 HeLa 细胞同步感染实验中，研究人员在不同时间点加入 CsA 以破坏 CypA 与衣壳的结合。结果发现，HIV-1_AC-1的感染性在加入 CsA 时达到最大，随后逐渐下降。在感染后 6 小时内加入 CsA，HIV-1_AC-1的感染仍可部分恢复，但 6 小时后加入 CsA 则无法显著恢复感染性。这表明，HIV-1_AC-1衣壳不会因 CypA 结合而立即失稳，但在感染后 6 小时会发生不可逆变化。

（四）CypA 对 HIV-1 核输入的影响

由于 HIV-1_AC-1衣壳稳定性与 WT HIV-1 相当，研究人员进一步研究了其核输入过程。通过定量 WT HIV-1 和 HIV-1_AC-1的gag DNA 拷贝数，研究人员发现，两者在逆转录过程中合成的逆转录本数量相似，这说明 HIV-1_AC-1的逆转录过程未受影响。而通过 2 - 长末端重复序列（2-LTR）环检测发现，HIV-1_AC-1感染导致的 2-LTR 环水平较低，经 CsA 处理后可恢复到 WT HIV-1 水平，这表明 HIV-1_AC-1的核输入受到限制，且这种限制可通过阻断 CypA 结合来解除。

为了更准确地研究核输入动力学，研究人员进行了核输入动力学（NIK）实验。结果显示，WT HIV-1 的感染半衰期在有无 CsA 处理时无显著差异，而 HIV-1_AC-1在未处理时核输入几乎检测不到，经 CsA 处理后，其核输入半衰期与 WT HIV-1 相似。这进一步证实，增加 CypA 与 HIV-1_AC-1衣壳的结合会导致核输入失败，而阻断 CypA 结合可恢复核输入。

此外，研究人员还发现，HIV-1_AC-1感染在非分裂细胞中的限制更为明显，而 CsA 处理可使 HIV-1_AC-1在非分裂细胞中的感染性恢复到 WT HIV-1 + CsA 的水平，这表明 HIV-1_AC-1在非分裂细胞中利用核孔复合体（NPC）进行核输入的过程依赖于 CypA 结合的抑制。同时，研究人员对 NUP358 的 CypA 同源结构域（CHD）在 HIV-1_AC-1感染中的作用进行了研究，结果发现，敲除 NUP358 CHD 对 HIV-1_AC-1感染无显著影响，这表明 NUP358 CHD 与 HIV-1_AC-1感染受限无关。

（五）细胞质和细胞核中 CypA 的作用

研究人员发现，CypA 在 HeLa、SupT1 和 HT1080 细胞中的表达主要集中在细胞质，且被排除在细胞核和与微管组织中心重叠的核周区域之外。为了探究细胞质中 CypA 的定位是否对 HIV-1 核输入至关重要，研究人员使用了 CRISPR 编辑的 HT1080 细胞系，该细胞系删除了PPIA基因。实验结果显示，在 HT1080CypA^?/?细胞中，HIV-1_AC-1的感染性可恢复到 WT HIV-1 水平，且不受 CsA 处理的影响。外源性表达 CypA 可使 WT HIV-1 和 HIV-1_AC-1的感染模式恢复到对照 HT1080 细胞的水平，而表达 CypA-NLS（使 CypA 仅在细胞核中表达）则无法恢复感染模式。这表明，细胞质中的 CypA 表达对 HIV-1 核输入和感染具有重要的调节作用，而细胞核中的 CypA 则不具备这种调节能力。

（六）CypA 与 CPSF6 的相互作用

由于 N74D 突变可挽救 HIV-1_AC-1的感染性，且 CypA 结合会限制 CPSF6 与 WT HIV-1 衣壳的结合，研究人员进一步探究了 HIV-1_AC-1衣壳与 CPSF6 的相互作用。在 HeLa 细胞表达 GFP-CPSF6 的实验中，研究人员发现，WT HIV-1 感染可导致可见的 CPSF6 高阶复合物形成，而 HIV-1_AC-1感染在未添加 CsA 时，几乎检测不到 CPSF6 复合物，添加 CsA 后可恢复到 WT HIV-1 水平。这表明，增加 CypA 与 HIV-1_AC-1衣壳的结合会减少 CPSF6 与衣壳的结合。

研究人员还通过表达截短的 CPSF6-358（缺乏与 TNPO3 结合所需的 RS 样结构域，导致其在细胞质中积累并保持与 HIV-1 衣壳的结合）进行实验。结果显示，WT HIV-1 可产生可见的 CPSF6-358-GFP 复合物，而 HIV-1_AC-1在未添加 CsA 时无法形成该复合物，添加 CsA 后可恢复。这进一步证实，CypA 与 HIV-1_AC-1衣壳的结合会抑制 CPSF6 与衣壳的结合。同时，研究发现，CPSF6-358 对 HIV-1_AC-1的限制作用依赖于 CsA 的存在，这表明 CPSF6-358 与 HIV-1_AC-1衣壳的结合受 CypA 的调控。

（七）CypA 对 HIV-1 整合位点的影响

CPSF6 可促进病毒核心定位到远离核膜的 SPADs 和基因丰富的染色质区域，从而使 HIV-1 优先整合到这些区域。研究人员对 HIV-1_AC-1的整合位点进行分析，结果发现，HIV-1_AC-1在未处理时，其整合位点的平均基因密度较低，且更倾向于整合到与核纤层相关结构域（LADs）相关的 DNA 区域，这与 N74D HIV-1（无法结合 CPSF6）的整合模式相似。而经 CsA 处理后，HIV-1_AC-1的整合位点表型可恢复到类似 WT HIV-1 的水平，即优先整合到基因丰富的区域和 SPADs，避免整合到基因稀疏的 LADs 区域。这表明，CypA 与 HIV-1_AC-1衣壳的结合会导致整合位点错误定位，而阻断 CypA 结合可恢复正常的整合模式，进一步强调了衣壳与细胞质 CypA 和 CPSF6 的结合对优化 HIV-1 整合的重要性。

三、讨论

本研究通过对 HIV-1_AC-1突变体的研究，深入揭示了 CypA 和 CPSF6 与 HIV-1 衣壳相互作用的机制及其对病毒复制的影响。研究发现，细胞质中的 CypA 与衣壳结合直接介导核输入并促进病毒复制，而增加 CypA 与 HIV-1_AC-1衣壳的结合会导致核输入失败和整合位点错误定位，这是由于 CypA 结合抑制了 CPSF6 与衣壳的结合。

在病毒感染过程中，CypA 和 CPSF6 与衣壳的结合存在时空调控。在细胞周边，CypA 与进入的衣壳结合，阻止 CPSF6 过早结合，随着衣壳向细胞核靠近，CypA 浓度降低，CPSF6 与衣壳结合，促进核输入和整合。而在 HIV-1_AC-1感染中，由于 CypA 与衣壳的结合增强，破坏了这种时空调控，导致病毒复制受阻。

此外，本研究还发现，HIV-1_AC-1的体外衣壳稳定性与 WT HIV-1 相似，且在感染后 6 小时内，其感染性可通过阻断 CypA 结合得到部分恢复，但 6 小时后则发生不可逆变化。这表明，在感染早期，HIV-1_AC-1衣壳可能保持相对完整，而后期的不可逆变化可能与衣壳的构象改变或其他未知因素有关。

值得注意的是，分析 20,000 个 HIV-1 组 M gag序列发现，HIV-1_AC-1中的多个突变具有高度多态性，这意味着在临床分离株中，CypA 与 HIV-1 衣壳的结合亲和力可能存在差异，进而影响病毒复制过程中宿主因子的结合，对发病机制产生影响。

本研究提出的宿主因子与 HIV-1 衣壳结合的时空调节模型，不仅适用于 CypA 和 CPSF6，还可扩展到其他与衣壳相互作用的细胞因子。这为深入理解 HIV-1 感染机制提供了新的视角，也为开发更有效的抗逆转录病毒疗法提供了重要的理论依据。未来的研究可进一步探究其他细胞因子在 HIV-1 感染中的作用，以及如何通过调节这些因子与衣壳的相互作用来阻断病毒复制，为艾滋病的治疗带来新的突破。