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为检测尼帕病毒（NiV），研究人员开发 POC-NAD 系统，其灵敏、特异，适用于现场检测。
# 尼帕病毒核酸现场检测新技术：开启防控新征程
在过去二十年里，尼帕病毒（Nipah Virus，NiV）这个隐匿在动物与人类之间的 “杀手”，多次在亚洲掀起疾病爆发的浪潮。它是一种人畜共患的病原体，致死率高达 75%，就像一颗随时可能引爆的 “炸弹”，威胁着人类和动物的健康。猪、蝙蝠等众多中间宿主，在不知不觉中成为了它传播的 “帮凶”，让其在人群中传播的风险与日俱增。
目前，现有的尼帕病毒检测方法都存在着各自的 “短板”。基于抗体的检测技术，像酶联免疫吸附测定（ELISA）和中和试验，容易受到病毒基因组快速突变和抗体亲和力的影响，导致检测的敏感性和准确性大打折扣；而中和试验对生物安全四级（BSL - 4）实验室设施的高要求，使得它很难在临床检测中广泛应用。聚合酶链反应（PCR）技术虽然敏感性高、特异性强，但现有的以 N 基因或其他区域为靶点的检测方法，存在无法区分病毒基因组和 mRNA 转录本等问题，影响了对病毒基因组的精准定量。此外，这些依赖昂贵设备的检测方法，在卫生条件差、资源有限的尼帕病毒高发地区，往往 “水土不服”，难以施展拳脚。
为了攻克这些难题，温州大学病毒学与免疫学温州市重点实验室、诸暨市动物科学研究所、中国农业科学院长春兽医研究所等多个研究机构的研究人员携手合作，开展了一项意义重大的研究。他们成功开发出一种基于现场核酸检测（point - of - care nucleic acid detection，POC - NAD）的系统，相关研究成果发表在《Scientific Reports》上。
研究人员为开展这项研究，主要运用了以下几种关键技术方法：
首先是核酸提取技术，采用 DNA/RNA 共提取试剂盒 - 磁珠法，从样本中精准提取病毒核酸。然后是便携式 PCR 仪器和一步法 RT - PCR 技术，该便携式 PCR 系统借助微流控芯片完成扩增，即便在条件不理想的现场环境下也能稳定工作；一步法 RT - PCR 则是将病毒 RNA 直接逆转录为 cDNA 并进行扩增，减少了操作步骤，降低了污染风险。最后，通过侧向流动免疫层析技术，利用胶体金双抗原夹心方法，将检测结果以可视化的方式呈现出来。
下面来看具体的研究结果：
- 基因分型分析和引物设计：研究人员仔细比对了来自 NCBI 数据库的 64 条尼帕病毒完整基因组序列，经过一系列复杂的分析流程，最终选定 P 和 G 基因作为检测靶点，并设计出两对高度保守的引物。从理论上来说，这些引物能够同时检测出 NiV - M 和 NiV - B 两种毒株1。
- POC - NAD 的特异性：研究人员对 POC - NAD 系统的特异性进行了严格测试。他们选用多种病毒的基因组作为样本模板，包括非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等。实验结果令人满意，阳性对照在检测线（T 线）和对照线（C 线）都出现了预期结果，而阴性对照组和其他病毒模板组仅在 C 线出现条带，这充分证明了该系统对尼帕病毒检测具有高度的特异性2。
- POC - NAD 的敏感性：为了验证 POC - NAD 系统对尼帕病毒检测的敏感性，研究人员将体外转录的 NiV - G 和 NiV - P RNA 模板进行不同浓度的稀释，从 1592.5 copies/rxn 到 99.55 copies/rxn 进行测试。结果显示，当阳性模板浓度高于 199.1 copies/rxn 时，P - 1 - X 和 P - 2 - X 引物在侧向流动试纸上均呈现阳性结果；当模板浓度低于 99.55 copies/rxn 时，则无法显示阳性结果。由此确定该系统的检测限（LoD）为 199.1 copies/rxn3。
- 模拟临床样本检测：研究人员模拟了 21 份临床样本，运用双靶点检测方法进行检测，并与 RT - PCR 方法的检测结果进行对比。令人惊喜的是，该双靶点检测方法成功检测出 16 份阴性模拟临床样本和 5 份阳性模拟临床样本，与 RT - PCR 方法的检测结果完全一致，这表明该检测策略具有良好的稳定性和准确性4。
在研究结论和讨论部分，研究人员开发的 POC - NAD 检测方法展现出诸多优势。它成本效益高，每次检测的试剂成本仅为 0.28 ± 0.02 美元，远低于 RT - qPCR 的 5 美元。从核酸提取到得出检测结果，整个过程大约只需一个小时，比目前常用的 qPCR 和 ELISA 等检测技术更加快速。而且，一步法逆转录和扩增过程避免了两步反应可能带来的样本交叉污染风险。不过，这项研究也存在一定的局限性，由于临床样本的缺乏，研究过程中没有使用活的尼帕病毒进行测试。但研究人员通过设计双靶点现场引物，在一定程度上确保了检测方法的广泛适用性和更高的准确性。
总的来说，这项研究成果意义非凡。POC - NAD 检测方法为尼帕病毒的现场检测提供了一种可靠、高效的新手段，有望成为猪生产系统及相关环境中尼帕病毒流行病学长期监测的有力工具，为防控尼帕病毒的传播、保障人类和动物的健康筑牢了一道坚实的防线。
