基于亲电片段的表型与活性联合分析揭示抗生素作用靶点

为应对抗生素耐药问题，康奈尔大学研究人员开展抗生素靶点发现研究，鉴定出 10 - F05 的靶点，为开发新抗生素提供依据。

　　在现代医学领域，抗生素是对抗细菌感染的有力武器，拯救了无数生命。然而，近年来抗生素耐药问题日益严峻，犹如一颗 “定时炸弹”，严重威胁着人类健康。许多常见细菌逐渐对现有抗生素产生抗性，使得原本有效的治疗手段失去效果，一些曾经容易治愈的感染性疾病，如今却变得棘手无比。这不仅增加了患者的痛苦和医疗成本，还可能导致一些感染性疾病的大规模爆发，引发公共卫生危机。为了寻找新的解决办法，科研人员一直在努力探索新的抗生素靶点和抗菌药物。

在这样的背景下，康奈尔大学（Cornell University）的研究人员开展了一项具有重要意义的研究。他们致力于通过整合半胱氨酸反应性片段的表型筛选与基于活性的蛋白质分析（Activity - Based Protein Profiling，ABPP），来发现抗生素的作用靶点，从而为开发新型抗菌药物提供关键线索。最终，他们取得了一系列重要成果，这些成果为解决抗生素耐药问题带来了新的希望。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。首先是化合物库筛选技术，他们使用包含 3200 种片段样共价配体的半胱氨酸靶向化合物库（Cys - library），对多种细菌进行筛选，以寻找具有抗菌活性的化合物。其次是 ABPP 技术，通过该技术鉴定与活性化合物相互作用的蛋白质靶点，确定了 10 - F05 的潜在靶点。此外，还运用了化学遗传学验证技术，利用过表达和基因敲除菌株，验证靶点与抗菌活性之间的关系，深入探究 10 - F05 的作用机制。

下面详细介绍该研究的具体结果：

1. 筛选抗菌活性化合物：研究人员从 Enamine 获得半胱氨酸靶向化合物库后，先评估其在 HEK293T 细胞中的细胞毒性。随后，对该化合物库进行筛选，以鉴定对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和霍乱弧菌（V. cholerae）有活性的化合物。经过一系列筛选和排除高细胞毒性及含毒性基团的化合物后，对剩余的氯甲基酮类化合物测定其对多种病原体的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）。结果发现，多数氯甲基酮类化合物的 MIC 在 5 - 50 μM 之间，且硫醇反应性与抗菌活性并不相关，这表明 10 - F05 的非共价部分在与靶点结合中起着重要作用。
2. 10 - F05 的抗菌特性及耐药性研究：在众多氯甲基酮类命中化合物中，10 - F05 对大多数测试菌株表现出最有效的抗菌活性，它能抑制多种 ESKAPE 病原体。时间依赖性杀伤实验表明，2.5 mM 的 10 - F05 能在 24 小时内消除 99% 的福氏志贺菌（S. flexneri）。同时，10 - F05 在 HEK293T 细胞中细胞毒性较低。在耐药性研究方面，通过对金黄色葡萄球菌和福氏志贺菌进行传代实验发现，10 - F05 在这两种菌中的耐药发展速度较慢，且 10 - F05 耐药菌株对其他常用抗生素类没有显著的交叉耐药性，这暗示了 10 - F05 独特的作用机制。
3. 鉴定 10 - F05 的靶点：研究人员运用 ABPP 技术在福氏志贺菌中鉴定 10 - F05 的潜在靶点。他们发现 FabH Cys₁₁₂、MiaA Cys₂₇₃和 PdxY Cys₁₂₁是 10 - F05 的主要靶点。其中，FabH 参与细菌脂肪酸合成，是已被验证的抗生素靶点；MiaA 负责 tRNA 修饰，对细菌适应性和毒力至关重要；PdxY 是参与磷酸吡哆醛（Pyridoxal 5⁰ - phosphate，PLP）挽救途径的吡啶醛激酶，但其具体功能尚未完全明确。通过表达和纯化相关重组蛋白，并进行荧光标记实验，进一步证实了 10 - F05 与这些靶点蛋白的相互作用。
4. 验证靶点与抗菌活性的关系：为了验证这些靶点与 10 - F05 抗菌活性的相关性，研究人员进行了一系列实验。利用已知的 FabH 抑制剂 platencin 进行对比实验，发现 10 - F05 耐药的金黄色葡萄球菌菌株对 platencin 也有抗性，这表明 FabH 抑制是 10 - F05 发挥抗菌作用的关键机制之一。通过在大肠杆菌中过表达或敲除相关靶点基因，研究发现 FabH、MiaA 和 PdxY 的过表达会增加 10 - F05 的 MIC，而基因敲除则使大肠杆菌对 10 - F05 更敏感，进一步证实了这些蛋白是 10 - F05 的关键靶点。此外，对 10 - F05 耐药的金黄色葡萄球菌进行全基因组测序，发现可能存在一种类似 YiiD 的蛋白上调，这或许是其耐药的潜在机制。
5. 10 - F05 对 MiaA 功能的影响：研究人员聚焦于 MiaA Cys₂₇₃，通过定点突变、共价对接和凝胶迁移实验等发现，10 - F05 与 MiaA Cys₂₇₃特异性反应，且这种共价修饰会干扰 MiaA 与 tRNA 底物的结合。体外酶活性实验表明，10 - F05 处理会降低 MiaA 修饰 tRNA 的初始速度。在体内实验中，利用双荧光素酶报告质粒和 LC - MS 分析发现，10 - F05 会抑制 MiaA 活性，导致翻译保真度降低、细菌应激抗性和毒力下降。

研究结论与讨论部分强调了该研究的重要意义。通过筛选半胱氨酸靶向化合物库，研究人员发现了一系列具有抗菌活性的化合物，其中 10 - F05 展现出广谱抗菌活性和缓慢的耐药发展速度。确定的多个靶点中，FabH 是已知的抗生素靶点，10 - F05 对其抑制作用在革兰氏阴性菌中效果显著；MiaA 和 PdxY 则是此前未被认可的抗生素靶点，10 - F05 有望成为开发针对这些新靶点选择性抑制剂的基础。此外，10 - F05 的多靶点作用机制可能降低细菌耐药性的产生，为开发更持久有效的抗生素提供了新的思路。然而，研究也存在一定局限性，如仅在富含营养的实验室培养基中对病原菌进行筛选，10 - F05 未在动物感染模型中测试等。未来需要进一步优化 10 - F05，并在更生理相关的条件下筛选共价化合物库，以推动新型抗生素的开发。总之，该研究为抗生素靶点的发现和新型抗菌药物的研发提供了重要的理论基础和实践指导，具有广阔的应用前景。