综述：异物巨细胞（FBGCs）体外研究的方法学回顾：现状、挑战与标准化指南

该综述分析了异物巨细胞（FBGCs）研究的常用方法，指出问题并提出标准化建议，助力相关研究。

　　

一、引言

生物材料在医疗领域应用广泛，从人工心脏瓣膜到伤口敷料等都有涉及。然而，生物材料植入人体后会引发免疫反应，其中异物巨细胞（Foreign Body Giant Cells，FBGCs）在异物反应（Foreign Body Response，FBR）中起着关键作用。FBGCs 由单核细胞 / 巨噬细胞系细胞融合而成，在生物材料 - 组织界面持续存在。它具有多种功能，既可以通过形成纤维层包裹异物，促进可降解生物材料的降解，还参与免疫调节、组织降解与形成以及血管生成等活动。但在不同的应用场景下，FBGCs 的作用存在差异，在一些情况下，它可能对植入物有害，引发氧化应激开裂，导致临床设备失效；而在原位组织工程应用中，其降解能力又有助于平衡植入物降解和组织再生。

目前，虽然对生物材料特性影响 FBGCs 形成的研究众多，但由于缺乏标准化的实验方案，不同研究在细胞类型、融合诱导方式、融合量化方法以及多核巨细胞定义等方面存在差异，这使得研究结果难以直接比较，也无法明确影响 FBGCs 形成的主要因素。因此，深入了解 FBGCs 的形成和功能，对于评估生物材料的安全性和有效性至关重要，而统一研究方法是实现这一目标的关键。

二、研究方法

1. 数据库检索：通过在 PubMed 数据库中使用预定义检索词进行检索，并补充相关重要文献的参考文献，确保涵盖该领域的关键研究。检索时间截至 2024 年 7 月 25 日，之后将检索结果导出并进行后续处理。
2. 筛选过程：利用 Rayyan 网络系统评价软件对 PubMed 文件进行筛选，去除重复项、错误的出版物类型（如综述、评论、信件等）以及非英文文章。对于因订阅限制未获取的高引用文章进行评估，最终确定符合条件的文章进入后续分析。同时，根据文章标题和摘要进一步筛选，排除体内、卵内实验，非单核细胞 / 巨噬细胞系融合细胞实验，以及使用特定融合方法（如聚乙二醇（PEG）融合、病毒融合）等不符合要求的研究。对于标题和摘要中无法明确是否进行体外 FBGCs 形成实验的文章，则进入全文筛选。
3. 数据分析：对纳入的文章记录相关信息，包括 PMID、标题、作者、实验使用的细胞类型、细胞来源、分离方法、培养条件（培养基、血清、抗生素、接种密度、培养表面、培养时间）、融合诱导细胞因子以及实验结果（MGC 定义、形成数量、命名、细胞核数量、细胞核组织、表面积）等。若文章存在多个实验，仅记录每种细胞类型中 MGC 形成率最高的实验条件，但会记录其他相关实验条件。部分信息缺失时，根据具体情况进行标注或计算。此外，对细胞分类、血清类型等信息进行统一记录和处理。
4. 统计分析：由于纳入研究在方法、设计和测量技术等方面差异较大，且许多研究缺乏完整数据集和实验重复次数的清晰记录，因此未对数据进行统计分析。

三、研究结果

1. 检索结果：检索和补充参考文献共得到 2157 篇文章，经过筛选，最终 263 篇文章符合纳入标准。体外 MGC 形成的研究始于 20 世纪 70 - 80 年代，随后呈上升趋势，在 2008 年达到峰值（13 篇）。341 项实验中，57 项使用微生物诱导融合，其余 284 项主要使用细胞因子及其他物质（如佛波酯 - 12 - 肉豆蔻酸酯 - 13 - 乙酸酯（PMA）、伴刀豆球蛋白 A（ConA）、脂多糖（LPS）等）。在使用细胞因子的实验中，人源和鼠源细胞模型的实验数量相对接近，但鼠源细胞实验中 68% 使用小鼠细胞，人源细胞主要来源于血液，鼠源细胞则主要来自骨髓、腹膜或肺泡。由于人源和鼠源细胞研究占比达 83%，后续数据主要聚焦于此，同时排除使用微生物诱导融合和永生化细胞系的实验。
2. 基本培养条件：在人源细胞培养实验中，RPMI - 1640 是最常用的培养基（141 项实验中使用 74 次），但部分实验会在不同阶段更换培养基。血清补充浓度在 2% - 33% 之间，人源细胞培养中人类血清（hS）与胎牛血清（FBS）使用比例为 66:53，且 hS 平均浓度（20%）是 FBS（10%）的两倍。在培养表面方面，43% 的人源细胞实验使用组织培养处理的聚苯乙烯（TCPS）。

鼠源细胞培养实验中，Opti - MEM、MEMα 和 RPMI - 1640 是常用培养基（79 项实验中分别使用 16、16 和 14 次），同样存在培养基更换情况。血清使用上，FBS 占主导（67 次），hS 仅使用 5 次。培养表面除 TCPS（31%）外，Permanox? 在鼠源细胞研究中使用比例也较高（21%）。3. FBGC 形成方法：研究识别出四种 FBGC 形成方法。方法 A 是先将骨髓、脾脏、肝脏或血液来源的单核细胞（或含单核细胞的细胞悬液）在（粒细胞）巨噬细胞集落刺激因子（(G) M - CSF）等分化剂作用下分化为巨噬细胞，再添加细胞因子或异物诱导巨噬细胞融合成 FBGCs；方法 B 是使用已分化的巨噬细胞（如人肺或鼠肺、腹膜、脑、脾脏来源），通过添加细胞因子或异物诱导融合；方法 C 是直接诱导单核细胞（或类似来源的细胞悬液）融合，不明确区分单核细胞向巨噬细胞的分化和巨噬细胞间的融合阶段；方法 D 是针对鼠源细胞研究的特定方法，先给小鼠体内注射分化剂（如硫代乙醇酸盐），再获取巨噬细胞进行体外 FBGCs 融合研究。

多数人源细胞实验采用方法 A（60 次）和方法 C（58 次），鼠源细胞实验则更倾向于方法 A（36 次），方法 B、C、D 在鼠源细胞实验中的贡献相似。在分化因子使用上，M - CSF 在人源和鼠源细胞实验中应用较多，但在融合阶段 GM - CSF 使用更频繁。IL - 4 是主要的融合诱导因子（占 59%），此外还有 ConA 等其他因子。人源细胞诱导 FBGCs 形成的时间（5 - 10 天）长于鼠源细胞（2 - 6 天），且人源细胞的平均接种密度（1.5×10⁶ cells/cm²）高于鼠源细胞（2.3×10⁵ cells/cm²）。4. FBGC 结果定义：在判别 MGCs 与单核巨噬细胞时，73% 的研究以细胞内细胞核数量为参数，但具体定义并不统一，从含多于 1 个细胞核到多于 4 个细胞核不等。在量化 MGCs 数量时，120 项实验（206 项量化实验中）使用融合百分比（% Fusion），其他实验采用每孔 MGCs 数量或其他替代方法（如抗酒石酸酸性磷酸酶阳性（TRAP +）细胞、细胞大小等）。在术语使用上，MGC 和 FBGC 是最常用的术语，但也存在其他术语，且部分实验对巨细胞的命名不统一。此外，关于细胞核数量、核组织和细胞表面积等信息在研究中很少被报告。5. 融合程度：实验中融合百分比（% Fusion）差异较大，从几乎无融合到接近 100% 融合都有。人源细胞实验的平均 % Fusion 为 61%，鼠源细胞实验为 43%。不同方法、培养基、血清类型、接种密度和 IL - 4 浓度对 % Fusion 的影响未呈现明显趋势，但使用无血清培养基（SFMFM）和 DMEM 的实验平均融合率有所增加，使用人血清的实验平均 % Fusion（约 60%）高于使用 FBS 的实验（50%）。

四、标准化的呼吁

1. 报告和标准化培养基及血清：在研究中，对基本培养条件（如培养基和血清）的选择缺乏统一报告，这给研究结果的理解和重复性带来困难。不同研究使用不同的培养基和血清，且未充分说明选择理由，导致结果矛盾难以解释。例如，不同研究中单核细胞在不同培养条件下成熟后形成 MGCs 的能力差异，可能与培养基、血清等多种因素有关。因此，明确报告基本培养条件的选择依据，并制定标准化的培养方案，对于解决当前研究中的矛盾至关重要。
2. 细胞类型的选择：虽然普遍认为 FBGCs 来源于单核细胞 / 巨噬细胞系，但关于其前体细胞是单核细胞还是巨噬细胞存在争议。现有研究中，获取 FBGCs 的方法多样，且不同方法对融合率的影响不明确。部分研究在细胞类型判断上存在假设，缺乏数据支持，如将体内激活小鼠的细胞直接认定为巨噬细胞，或未经过严格分选就将贴壁的血液单核细胞认定为单核细胞。此外，体内研究表明 MGCs 的形成时间与细胞成熟时间存在差异，这也增加了确定前体细胞类型的复杂性。因此，需要进一步研究明确影响前体细胞类型差异的因素，以及哪种模型更能代表体内情况。
3. 细胞来源：体外培养 FBGCs 使用的细胞来源和分离技术多样，包括人源和动物源细胞。不同动物模型和人源细胞之间存在显著差异，人源细胞供体间也存在较大变异，这使得研究结果难以比较。永生化细胞系虽使用方便，但在诱导 FBGCs 形成方面存在局限性，多数相关实验融合率较低。人源细胞主要来源于血液，鼠源细胞来源广泛，且小鼠在实验前常接受分化剂处理，影响细胞极化和激活状态，进一步增加了研究结果比较的难度。
4. 融合诱导因子的选择：融合诱导因子（FIF）是获得 MGCs 的关键因素，不同的 FIF 可诱导产生不同的 MGCs。IL - 4 是研究 FBGCs 时最常用的 FIF，但部分研究显示其存在抑制融合的情况，需要重复实验探究原因。ConA 或 ConA 条件培养基（CM）也是常用的 FIF，但其诱导融合的机制复杂，与 IL - 4 诱导的极化状态相反，且不同研究结果存在矛盾。此外，生物材料特性对巨噬细胞表型、功能和融合的影响虽已被认识，但具体的相互作用机制仍不明确。因此，选择合适的细胞类型、来源和 FIF 对于研究目标的实现至关重要。
5. 巨噬细胞极化状态：不同 FIF 诱导的信号通路变化涉及巨噬细胞极化状态与 FBGCs 形成的关系。近期研究表明，M1 样巨噬细胞在 FBGCs 形成和纤维包裹过程中占主导地位，但也有观点认为巨噬细胞在融合过程中会发生极化转变。M1 和 M2 巨噬细胞的代谢方式不同，不同 MGCs 的代谢状态也存在差异，但 FBGCs 的代谢情况尚未明确。目前的研究未充分探讨巨噬细胞极化对 FBGCs 形成和功能的影响，而生物材料植入可能诱导不同的巨噬细胞极化状态，进而影响 FBGCs 的数量和功能，因此这是未来研究的一个重要方向。
6. 量化和定义的不一致性：多数研究以多核作为定义 MGCs 的主要特征，一般认为多于 2 个细胞核代表 MGCs，以避免将分裂细胞误判为 MGCs。% Fusion 是常用的量化方法，但它存在局限性，不能反映每个 MGCs 中的细胞核数量等信息。此外，许多研究在描述 MGCs 时缺乏详细信息，如细胞形态、核组织等。为减少偏差和实验室间差异，提高分析速度，应开发基于标准化标记的自动量化方法，全面测量和报告相关参数。
7. 区分 FBGCs 与其他 MGCs：近 50% 的实验未明确所获得的 MGCs 类型，这主要是由于缺乏清晰的定义。对于研究较多的 OC，可通过骨吸收和 TRAP 表达来确定，但区分 FBGCs 和 LGCs 存在困难。目前常用核组织来区分两者，但研究发现这种方法存在矛盾，核组织可能不是区分不同 MGCs 的有效标记。虽然有研究尝试寻找区分 MGCs 的标记，但尚未找到金标准。不同研究中对 MGCs 的定义和分类常根据研究对象的不同而不同，这种基于简单标准的定义并不总是准确的。
8. 本综述的局限性：本综述在文献检索过程中可能未涵盖所有相关出版物，由于历史上使用的名称和细胞因子众多，检索词难以精确调整。在数据提取过程中，存在部分数据缺失或不一致的情况，且由于语言限制排除了非英文研究，可能遗漏重要信息。此外，综述仅使用了 PubMed 数据库，可能限制了研究的广度。不同研究间的巨大差异也阻碍了对影响 FBGCs 形成因素的深入探讨。

五、结论和未来方向

本综述的数据未能确定体外诱导 FBGCs 形成的关键通用因素，培养方案的多样性阻碍了研究间的比较。为推动 FBGCs 研究的发展，需要保持研究的一致性、清晰性和全面性，详细记录研究方法，包括成功和失败的尝试。

为此，建议建立标准化的培养方案，包括培养基、血清、培养表面、细胞类型、接种密度、单核细胞 / 巨噬细胞成熟时间、MGC 定义、量化方法和术语等方面。在诱导 FBGCs 的总体方法上，优先推荐方法 A，即先分化单核细胞为巨噬细胞，再诱导融合，因为这种方法可根据生理条件调整巨噬细胞极化状态，且使用人血来源的单核细胞具有生物学相关性，成本相对较低。具体操作建议是使用（G）M - CSF（30 ng/mL）诱导单核细胞分化为巨噬细胞，分化时间为 5 天，之后可进行 2 天的极化或 5 天的融合诱导。为减少高接种密度对融合的影响，建议接种密度保持在约 5×10⁵ monocytes/cm² 。由于人血来源单核细胞供体间差异较大，建议至少使用 5 个供体的细胞，或混合多个供体的巨噬细胞以降低差异。

在培养基选择上，基于现有数据，RPMI - 1640 可作为标准化的起点，但需要对常用培养基的融合效果进行对比研究。建议在 RPMI - 1640 中仅添加 L - 谷氨酰胺（维持细胞存活）和青霉素 / 链霉素（防止污染）。在血清使用上，优先选择 hS，且浓度保持在 5% 以减少血清成分对融合的影响。对于培养表面，研究特定生物材料时应选择相应材料，基础研究则建议使用 TCPS 或玻璃，且不进行涂层处理以减少变异性。在 FIF 选择上，推荐使用 IL - 4（10 ng/mL），并将形成的 MGCs 命名为 FBGCs。同时，研究人员应报告更多信息，如总细胞核数量、大小分布、每个 FBGCs 的细胞核数量和代表性图像等。为减少偏差和提高量化速度，开发基于标准化标记的自动量化方法至关重要。

此外，未来应开发更先进的体外培养模型，涵盖 FBGCs 形成过程以及与其他细胞类型的相互作用。生物材料的异物反应不仅涉及巨噬细胞 / FBGCs 与生物材料的相互作用，还包括与血液接触、中性粒细胞、T 细胞和成纤维细胞等的复杂相互作用。已有研究表明 T 细胞对巨噬细胞融合有显著影响，未来研究应聚焦于阐明这些细胞间的相互作用，了解 FBGCs 在体内的形成机制、功能以及如何调节这些反应以优化生物材料的治疗效果。诱导多能干细胞（iPSC）来源的单核细胞 / 巨噬细胞可能是研究的新方向，它可降低供体间差异，提供更多细胞数量，还可用于研究特定疾病状态下 FBGCs 的形成，但 iPSC 也存在一些局限性，且目前尚无诱导其分化为 FBGCs 的成熟方案。

总之，当前 FBGCs 研究在方法学上存在碎片化问题，标准化培养和量化方案的建立对于推动该领域研究、提高研究结果的可重复性和可靠性、促进更有效生物材料疗法的开发具有重要意义。