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来自美国的研究人员为探究 KLF2、4、5、6 在肿瘤细胞中的作用，对相关细胞开展研究，为肿瘤研究提供新视角。
细胞的机械生物学在发育、正常组织功能以及疾病中发挥着核心作用。在多细胞生物里，细胞与物理环境的相互作用通常存在双向影响，细胞外基质（ECM）的变化传递给细胞并被细胞感知，之后细胞会改变自身功能来适应或者进一步改变环境。机械敏感转录因子（MSTFs）会根据微环境的物理变化来调整细胞行为。像纤维化、动脉粥样硬化以及肿瘤发生等病症，都伴随着细胞环境机械特性的显著改变，并且在理解这些疾病中导致转录模式改变的一系列事件进展方面，已经取得了重大进展。
Krüppel 样转录因子（KLFs）是一类在机械转导过程中作用日益受到重视的转录因子家族。KLFs 因其与参与果蝇胚胎分割的缺口基因 Krüppel 相似而得名。目前在哺乳动物中已识别出 18 种 KLFs 以及一些假基因。KLFs 在发育和疾病中发挥着多种作用，可分为三类，即第 1 组（KLF3、8 和 12）、第 2 组（KLF1、2、4、5、6 和 7）和第 3 组（KLF9、10、11、13、14 和 16 ）。第 1 组和第 3 组主要作为转录抑制因子发挥作用，而第 2 组 KLFs 根据细胞类型和具体情况，既可以促进转录抑制，也可以促进转录激活。
已有研究表明，一些 KLFs 可作为 MSTFs。在血管内皮细胞中，KLF2和 4 参与将流体剪切力转化为细胞反应的过程。层流剪切流可维持 KLF2/4 的表达，这与抗血栓和抗炎基因活性以及血管健康的维持有关。然而，湍流模式的剪切流会抑制 KLF2/4 的表达，进而促进局部硬化、炎症以及动脉粥样硬化斑块的形成。流体剪切模式可通过 MEKK2/3 - MEK5 - ERK5 - MEF2 通路与 KLF2/4 的调节相关联。KLFs 的其他与机械作用相关的功能还体现在纤维化和癌症方面。KLF2和 4 的活性通常对纤维化有抑制作用，而 KLF5和 6 则倾向于促进纤维化，但也存在一些例外情况，它们的作用尚未完全明确。纤维化的一个基本特征是组织硬化，主要是通过细胞外基质的改变实现的。局部硬化和胶原蛋白的过度沉积（促结缔组织增生）也是许多实体瘤的标志，细胞外基质硬化在癌症进展中的作用已得到广泛认可。有趣的是，不断生长的肿瘤通常会因基质变化而硬度增加，而恶性细胞自身却可能变软。大量研究记录了多种癌症中 KLF 表达的变化，但与纤维化情况类似，这种关系较为复杂。不同的 KLFs 在不同类型的转化细胞中发挥着不同作用，有些甚至在不同癌症中表现出相反的作用。
乳腺癌是许多与机械作用相关研究的重点对象，临床上已明确乳腺密度与癌症风险之间存在关联。随着乳腺上皮组织和胶原基质含量与脂肪含量的比例上升，乳腺硬度增加，这与患乳腺癌的风险升高相关，并且有假设认为风险程度反映了乳腺组织处于硬化状态的累积时长。生物信息学研究表明，KLF2/4/6/8/9/11/15 在乳腺癌中表达下调，较高的 KLF2、4 或 15 表达与更好的预后相关，而高表达 KLF8或 KLF11的肿瘤预后较差。KLF2和 KLF15被认为是独立的预后因素，KLF4被提议作为乳腺癌的潜在诊断标志物。然而，KLF4在癌症中的表达和功能明显较为复杂，且依赖于具体环境，这一特点也与其他 KLFs 相同。
除了肿瘤硬度变化，恶性细胞经历的另一组重要物理变化与转移过程有关。在转移过程中，通过血液或淋巴途径扩散的细胞在进入血管时，会从与细胞外基质的接触状态突然转变为悬浮在血液或淋巴中的状态。目前仍缺乏对 KLFs 作为 MSTFs 在伴随肿瘤生长和转移的物理转变过程中所起作用的详细了解。KLFs 在癌症中功能复杂，很大一部分原因可能是由于存在于机械特性不断变化的肿瘤亚区域中的转化细胞亚克隆，这导致了 KLF 表达在时间和空间上的差异调节。为了探究这种可能性，研究人员在 4T1、4T07 和 67NR 细胞（这些细胞是源自同一自发性小鼠乳腺肿瘤的肿瘤亚克隆）经历特定物理微环境变化后，对 KLF2、4、5 和 6 表达的体外机械反应性进行了研究。
该研究旨在解决两个问题：一是在适应特定物理微环境的肿瘤细胞亚克隆中，KLF2、4、5 和 6 的表达水平是否存在差异；二是这些 KLFs 的表达是否会对物理环境的快速变化产生响应。对于第一个问题，研究人员通过比较在以下三种条件下培养两天的亚克隆中 KLF 的表达模式来进行探究：a）标准塑料培养皿表面；b）3D 胶原凝胶中；c）液体悬浮培养中。这些条件可以用来比较从非常硬（2D 培养皿表面）到更接近生理状态（3D 胶原基质培养），再到非常软（液体悬浮培养中完全没有底物或基质附着）的物理微环境。对于第二个问题，研究人员通过测量以下处理后的 KLF 表达变化来进行研究：a）使用胰蛋白酶 - EDTA 将附着在培养皿上的细胞悬浮起来（代表从非常硬到非常软环境的最大、夸张的变化）；b）使用胶原酶将悬浮在 3D 胶原凝胶中的细胞解离（代表由于酶促底物解离导致细胞张力更符合生理状态的降低）；c）在保持 3D 胶原基质连接完整的同时仅消散细胞张力（通过非酶促方式将附着的凝胶从多孔板上释放）。为了深入了解细胞亚克隆对胶原基质施加的拉力，从而估计基质消化或物理凝胶从多孔板附着处释放时张力变化的程度，研究人员进行了胶原凝胶收缩实验。此外，研究人员还通过 siRNA 敲低方法、KLF 靶基因表达检测、形态学检查以及胶原侵袭实验，评估了 KLF 表达变化对细胞行为的潜在影响。
细胞培养方面，4T1 细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，CRL - 2539），4T07 和 67NR 细胞由 Fred Miller 博士（韦恩州立大学）慷慨馈赠。培养基为含有 4.5g/L 葡萄糖和丙酮酸的杜氏改良 Eagle 培养基（康宁公司，纽约州康宁），分别添加 Glutamax（赛默飞世尔科技公司，马里兰州盖瑟斯堡）和胎牛血清（HyClone），使其终浓度分别达到 6mM 和 10%。贴壁的 2D 培养细胞在塑料细胞培养皿中生长，并使用胰蛋白酶 - EDTA 进行传代培养。
4T1、4T07 和 67NR 细胞在不同物理环境下具有不同的表型特征。在 2D 塑料培养皿中，4T1 细胞形成扁平的上皮样集落；相比之下，67NR 细胞形成较小的细长不规则形状细胞簇，4T07 细胞主要以独立的纺锤形细胞形式生长。在 3D 边界粘附的胶原凝胶（即细胞在附着于培养皿的胶原凝胶中生长）中……（此处原文未完整描述该部分内容 ）。
本研究使用的 “4T1 系列” 细胞系于 20 世纪 70 年代末至 80 年代从单个自发性小鼠乳腺肿瘤中建立，包括 5 个致瘤亚克隆：4T1、66cl4、4T07、168FARN 和 67NR 。这些亚克隆的转移能力各不相同，本研究涉及其中 3 个：4T1 可转移至肺和肝脏；4T07 可到达肺部，但不会形成继发性肿瘤；67NR 不会离开原位。
该研究得到了明尼苏达州德卢斯市怀特赛德临床研究所以及明尼阿波利斯市费尔维尤健康服务公司的教师发展基金的资助。
Rafaela Marocci Lima Pimenta：负责研究的概念构思、方法设计、实验研究、正式分析、原始草案撰写以及可视化呈现；Cara Skon - Hegg：参与方法设计、验证、实验研究以及撰写审核与编辑；Teresa Rose - Hellekant：进行正式分析、提供研究资源、撰写审核与编辑并获取研究资金；Jon Holy：参与概念构思、方法设计、实验研究、原始草案撰写、监督研究进程、项目管理并获取研究资金。
作者声明在本论文所报道的研究工作中，不存在影响研究的财务利益冲突或个人关系。
