综述：3D 生物打印神经组织十年进展：方法、材料、模型及应用

本文系统回顾了近十年 3D 生物打印神经组织的研究，涵盖方法、材料等，展现其在疾病建模等方面的成果与挑战。

　　

1. 引言

神经组织不仅存在于大脑，还遍布中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）。大脑和脊髓构成 CNS，对人体功能、感觉能力以及多种神经退行性疾病的发生至关重要。大脑是一个复杂的器官，包含多种细胞成分、防御机制和突触通路，直接负责运动、记忆等人体活动。大脑组织主要由神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞等多种细胞组成，这些细胞通过复杂的相互作用形成神经网络，实现多种功能。同时，血脑屏障（BBB）作为大脑的重要组成部分，选择性地调节营养物质和激素的运输，对维持大脑内环境稳定和药物疗效起着关键作用。

传统的二维（2D）细胞培养和动物模型在研究大脑发育和功能方面存在局限性，无法准确复制人类大脑的复杂结构和功能。三维（3D）生物打印技术的出现为解决这些问题提供了新的途径。3D 生物打印可以创建更接近天然组织的复杂结构，有助于深入理解 CNS 的功能和疾病机制，在药物筛选、疾病建模和组织再生等方面具有巨大潜力。

1.1 3D 生物打印

由于人类大脑组织难以获取，且缺乏准确复制其发育和功能复杂性的实验模型，科学家对人类大脑的理解受到限制。2D 细胞培养作为大多数大脑模型的基础，存在诸多局限性，如缺乏组织的形态和空间组织、无法复制大脑的复杂 3D 结构以及忽略细胞间和细胞与细胞外基质（ECM）之间的关键相互作用等。因此，开发更复杂的 3D 模型对于更好地理解 CNS 至关重要。

3D 生物打印人类来源的神经细胞能够创建紧密模仿人类大脑组织结构和功能的复杂组织，还可以再现与人类脑部疾病相关的异常结构，如路易小体和淀粉样斑块，这在动物模型中往往难以实现。3D 生物打印通过逐层沉积生物墨水来实现精确的图案化和相关几何形状，相较于 2D 模型，能更好地模拟神经组织的复杂结构，为疾病模型的构建提供更具代表性的组织模型。

3D 生物打印技术主要包括以下几种：

1. 挤出式生物打印：这是一种广泛使用的技术，通过逐层沉积粘性生物墨水（如凝胶和细胞悬浮液）来创建 3D 结构。该方法具有通用性和成本效益，但在打印过程中对细胞施加的压力可能导致细胞存活率降低和组织功能受损。目前，研究人员正在通过优化打印参数（如喷嘴几何形状和挤出压力）来提高细胞活力和打印分辨率。
2. 液滴式生物打印：包括喷墨打印和声学打印，通过不同机制产生液滴并精确沉积。喷墨打印使用低粘度溶液，具有打印速度快和微米级精度的优点，但存在喷嘴堵塞和可打印生物墨水范围受限的问题。声学打印则通过声波定位生物墨水，可避免喷嘴堵塞，适用于打印敏感生物材料，但打印速度较慢且需要专用设备。
3. 光基方法：激光辅助生物打印（LAB）利用激光诱导正向转移（LIFT）技术，能够精确沉积细胞和生物墨水，创建高分辨率、复杂的 3D 细胞模型，具有高细胞活力和密度的优势。但该技术存在生产力有限和设备成本高的问题。此外，双光子聚合（TPP）作为 LAB 的一种技术，可实现亚微米级打印分辨率，但使用的专用激光器成本高，且光引发剂可能导致细胞毒性。
4. 立体光刻：使用光敏聚合物，通过光固化逐层制造复杂结构，具有高分辨率、能维持高细胞活力和打印时间一致性的特点。然而，该技术存在光固化剂毒性和潜在的 DNA 损伤等问题，且需要光聚合物填充的储液器，会导致材料浪费和成本增加。
5. 间接打印：使用牺牲性框架来支持聚合物基支架的形成，打印后去除支撑材料得到最终结构。该技术具有通用性，可将各种材料（包括生物活性物质）整合到支架中，但在神经组织再生方面的应用仍有待探索。
6. FRESH 打印：即自由形式可逆嵌入悬浮水凝胶（FRESH）生物打印，通过将低粘度墨水挤出到热可逆明胶微粒支撑浴中，能够打印柔软、脆弱的水凝胶，支持多种交联策略，可构建复杂的组织支架，如血管化心脏和神经模型，在外科手术训练和组织工程中有广泛应用。
7. 新兴打印技术：包括磁诱导和混沌生物打印等相对较新的技术。磁诱导生物打印通过用磁性纳米粒子（NPs）磁化细胞，利用外部磁体对细胞进行精确图案化，但在确保多种细胞表型的共培养和确定磁性 NPs 对细胞功能的影响方面存在局限性。混沌生物打印通过在打印头中引入混沌混合，生成指数复杂的混合界面，为细胞创造有利环境，具有模拟 BBB 的潜力。

1.2 其他模型

除了 3D 生物打印模型，还有其他类型的模型用于研究神经组织，如类器官、球体、3D 基质模型和器官芯片（OoC）等。类器官能够自我组织并模拟大脑结构的某些方面，但存在疾病表达有限和可重复性差的问题。球体是增殖的神经细胞簇，不具备成熟脑组织的复杂结构或功能。3D 基质模型通过在水凝胶中培养或嵌入特定细胞，提供了更高程度的标准化。OoC 系统通过模拟组织的生理结构和生化线索，为研究细胞行为、药物反应和疾病进展提供了精确控制的微环境，但由于其专业性和复杂性，本文未进行详细讨论。

动物模型在理解神经组织功能、病理和测试药物疗法方面广泛应用，但由于物种间解剖结构和发育轨迹的差异，直接将动物模型的研究结果转化为临床应用存在挑战。例如，小鼠大脑在大小、复杂性和区域组织方面与人类大脑存在差异，限制了其对人类大脑空间异质性和微环境的复制能力。

1.3 系统综述

本文旨在全面探索过去十年中 3D 生物打印神经组织（重点是神经脑组织）的研究工作，合理比较生物打印模型的方法、材料和表征，了解相关研究进展，并评估用于评估这些模型功效的方法类型。同时，在研究过程中发现，材料表征方法存在广泛差异，3D 生物打印构建体的表征应包括对其与人类神经组织相关性的恰当研究，如结构、基本功能和行为评估，以及在疾病模型中对疾病病理生理学的再现。

2. 方法

本系统文献检索遵循更新的 2020 年系统评价和荟萃分析首选报告项目（PRISMA）指南。检索了 PubMed、Scopus 和 Web of Science 三个数据库，使用 “3D 生物打印”“神经元细胞 / 大脑模型”“共培养” 和 “疾病” 等关键词，搜索过去十年（2014 年 1 月 1 日至 2024 年 12 月 8 日）的原始研究文章。在检索过程中，对不同数据库进行了相应的筛选，如在 PubMed 中排除综述文章和系统评价文章，在 Web of Science 中排除综述文章，在 Scopus 中仅纳入研究文章或 “ar” 文档类型。最后一次检索于 2024 年 8 月 12 日进行，由两名独立审稿人分别进行 3 关键词和 4 关键词搜索和筛选，并汇总结果。

文章导出后，首先通过阅读标题进行初步筛选，相关文章进一步评估摘要以确保适用性。对于标题和摘要无法明确判断的文章，评估其方法学。排除的原因包括非研究文章（如综述、评论或章节）、无生物打印相关内容等，并将排除原因记录在 Excel 中。对纳入的文章，记录模型类型、打印细胞类型数量、生物材料使用、构建体培养评估天数以及关键功能特征等信息，以推断 3D 生物打印神经组织的研究趋势。

3. 结果与讨论

通过搜索，在过去十年中，共找到 44 篇涉及 3D 生物打印神经组织模型用于疾病应用的研究论文，另外手动添加了 2 篇相关论文，最终纳入 46 篇文章进行分析。

3.1 模型

1. 大脑：建模大脑有助于深入了解神经系统和神经退行性疾病的复杂病理生理学。在过去十年中，3D 生物打印神经组织模型的复杂程度不断提高。例如，2015 年 Lozano 等人使用同轴针进行半手动 “3D 生物打印”，其神经模型使用 RGD 修饰的结冷胶（RGD-GG）与小鼠原代皮质神经元共打印，促进了细胞粘附和分化。2016 年 Gu 等人使用藻酸盐、羧甲基纤维素（CMC）和琼脂糖的生物墨水打印额叶皮质 hNSCs，研究了细胞在不同条件下的分化情况。此后，更多研究使用不同的生物墨水和细胞类型，构建了更复杂的大脑模型，如包含多种细胞类型的共培养模型，以模拟大脑的不同功能和疾病状态。
2. 脊髓：部分研究专注于脊髓模型的构建。Joung 等人使用基于 Matrigel 的生物墨水共打印神经祖细胞和少突胶质细胞祖细胞，为脊髓损伤的治疗提供了潜在的应用。de la Vega 等人使用微流体打印头打印 hiPSC 来源的 NPCs，研究了不同小分子组合对其向运动神经元分化的影响。Han 等人使用明胶基生物墨水成功打印了边界帽神经嵴干细胞和运动神经元前体与星形胶质细胞的混合物。Song 等人开发了一种导电复合水凝胶（CCH）支架，用于输送神经干细胞（NSCs）治疗脊髓损伤，在体内实验中显示出促进神经再生和改善运动功能的潜力。
3. 肿瘤模型：肿瘤模型，尤其是胶质母细胞瘤（GBM）模型，对于研究肿瘤的发生、发展和治疗具有重要意义。C. Lee 等人使用 3D 生物打印技术构建了 GBM 模型，观察到肿瘤细胞在构建体中形成球体并具有较高的活力。Smits 等人使用该模型评估了一种抗癌药物的效果，发现 3D 模型比 2D 模型更能准确反映肿瘤细胞对药物的反应。Tang 等人创建了具有不同刚度的 GBM 模型，研究了肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用以及药物在不同刚度环境下的疗效。Neufeld 等人在模型中引入了血管结构，更真实地模拟了体内肿瘤环境。
4. 其他模型：除了上述特定模型外，还有一些研究涉及通用的 CNS 模型和 hiPSC 扩增模型。Tomaskovic-Crook 和 Crook 建立了使用琼脂糖、CMC 和藻酸盐生物墨水打印 hNSCs 的协议，并探讨了导电生物墨水对细胞分化的影响。Kapr 等人使用藻酸盐、结冷胶和层粘连蛋白的水凝胶打印 hiPSCs 和 NPCs，评估了细胞的分化和增殖情况。Lindsay 等人制造了 NPC 扩增晶格，用于生成高质量的 NPCs，为 CNS 功能障碍治疗提供了潜在的细胞来源。

3.2 生物墨水

生物墨水为功能性神经网络的形成提供结构和化学支持，其设计对 3D 生物打印神经组织模型至关重要。不同的生物墨水聚合物具有不同的特性，影响着细胞的生存、分化和功能。

1. 聚合物：常见的生物墨水聚合物包括天然聚合物和合成聚合物。天然聚合物如藻酸盐、明胶、纤维蛋白原、GelMA、HA 等，具有良好的生物相容性和细胞粘附性。藻酸盐是最常用的聚合物之一，可与其他聚合物混合使用，以调节生物墨水的机械性能和降解性。明胶和 GelMA 具有热可逆凝胶化动力学，有利于挤出式生物打印，但 GelMA 的粘弹性在生理温度下稳定性有限。纤维蛋白原可促进细胞附着，但单独使用时打印性受限。合成聚合物如 Pluronic F127、PEDOT 和 PEG 等，具有独特的物理和化学性质，可用于增强生物墨水的性能，如导电性、稳定性等。
2. 添加剂：生物墨水中常添加一些支持分子，以增加其导电性、促进细胞分化或改善流变学性能。例如，Sharma 等人在生物墨水中添加了释放 guggulsterone 的微球（MSs），促进了 hiPSC 来源的 NPCs 向多巴胺能神经元的分化。Benwood 等人在 AD 模型中使用释放 puro 的 MSs，影响了 NPCs 的分化和电生理成熟。J. Li 等人在生物墨水中集成了四足形氧化锌（t-ZnO）微粒，用于检测 3D 生物打印构建体中的多巴胺。

3.3 细胞类型

1. 单一培养：过去十年的研究中，大多数探索了 3D 生物打印的单细胞培养（n = 35），常用的细胞类型包括 hNSCs、肿瘤细胞（如 U87、SH-SY5Y）、hiPSCs 等。这些单细胞培养在优化研究中有助于评估 3D 生物打印参数的影响，但与人类大脑的复杂性相比，其相关性有限。
2. 共培养：大脑的功能复杂性依赖于多种细胞类型之间的复杂网络，因此共培养在神经组织工程中具有重要意义。大多数共培养研究将神经细胞与胶质细胞（如星形胶质细胞）或胶质瘤细胞结合。星形胶质细胞在中枢神经系统中发挥着关键的功能和调节作用，包括突触发生、神经递质回收、免疫反应调节等。研究表明，将星形胶质细胞纳入 3D 生物打印神经模型中，可以更好地理解神经功能和神经系统疾病的机制。此外，一些研究还尝试了更复杂的共培养模型，如包含多种神经细胞和胶质细胞的模型，以更真实地模拟大脑的微环境。

3.4 3D 生物打印构建体

1. 几何形状：3D 生物打印构建体的几何形状多种多样，反映了其应用目的。常见的形状包括网格、圆顶形、长方体、圆柱形等。网格形状最为常见，可能是因为其易于构建且有利于细胞的生长和相互作用。一些研究还创建了具有血管化结构的构建体，通过使用牺牲性材料（如 Pluronic F127 和明胶）来模拟体内的血管网络，确保氧气和营养物质的供应，促进细胞的存活和功能。
2. 培养时间：3D 生物打印构建体的培养时间因研究目的而异。一些研究在较短时间内（如 1 - 2 周）评估细胞的存活和分化情况，而另一些研究则将培养时间延长至 30 天或更长，以观察细胞的长期行为和组织的成熟过程。较长的培养时间通常有助于形成更复杂的细胞网络和功能，例如在 Kajtez 等人的研究中，经过 2 个月的培养，观察到神经细胞之间形成了高度互连的网络。

3.5 3D 模型表征

1. 材料特性 - 无细胞：
   • 机械性能：3D 生物打印结构的机械性能对细胞行为和组织形成具有重要影响。常用的测试方法包括振幅扫描，用于研究材料的粘弹性行为，通过测量储能模量（G'）和损耗模量（G''）来评估材料的弹性和粘性。研究表明，神经干细胞在较软的基质（E < 1.5 kPa）中倾向于分化为神经元，而在较硬的基质中则更易发生胶质分化。此外，材料的刚度还会影响细胞的存活和形态，例如较软的水凝胶可促进星形胶质细胞的存活和降低细胞的圆度。
   • 物理性能：材料的物理性能，如润湿性、表面形态、孔隙率和降解性等，也对细胞 - 材料相互作用至关重要。哺乳动物细胞更倾向于附着在具有轻微正电荷的表面，而表面形态会影响细胞的附着和增殖。孔隙率和孔径大小影响营养物质和氧气的运输，以及细胞的增殖和分化。一般来说，较大的孔径有利于血管化和神经元分化，而较小的孔径可能会导致营养物质运输受阻和坏死区域的形成。
   • 打印性：打印性是指生物墨水有效沉积成 3D 结构并保持机械稳定性的能力。目前，对打印性的评估方法存在差异，一些研究通过测量打印结构的直径、圆度或与 CAD 文件的匹配程度来量化打印性，但缺乏统一的标准测试方法。
2. 材料特性 - 有细胞：
   • 细胞活力和增殖：细胞活力和增殖是评估 3D 生物打印组织质量的重要指标。常用的检测方法包括活 / 死成像、流式细胞术、AlamarBlue、CellTiter-Glo 等。不同的研究使用不同的方法和试剂来评估细胞活力，且在量化和标准化方面存在差异。细胞增殖的评估方法包括 MTT 测定、总 DNA 含量测定、CCK8、AlamarBlue 测定等，也可通过观察细胞数量、细胞圆度等间接指标来评估。
   • 蛋白质表达：蛋白质表达分析是确定 3D 生物打印模型功能的关键。常用的方法包括免疫细胞化学（ICC）、流式细胞术、共聚焦显微镜和 RT - qPCR 等。ICC 可用于定性和定量分析细胞标记物的表达，以评估细胞的分化和功能状态。RT - qPCR 则可用于定量检测特定基因的表达水平，但该方法依赖于 RNA 提取，可能无法直接反映蛋白质的表达情况，因此通常需要与 ICC 等方法相互印证。
   • 钙成像：钙成像用于研究神经元的基本功能，通过检测细胞内钙离子（Ca²⁺）的释放来评估神经元的自发或诱导活动。常用的钙指示剂如 Fluo - 4 AM 可用于基线钙成像，而 KCl、bicuculline 等试剂可用于诱导钙释放，以评估神经元的功能和成熟度。
   • 代谢活动和电生理学：代谢活动和电生理学分析可提供有关细胞功能的重要信息。代谢活动可通过检测 ATP 含量（如 CellTiter-Glo、CellTiter Blue）或评估特定代谢途径（如谷氨酸 - 谷氨酰胺途径）来评估。电生理学分析方法包括电压敏感染料、微电极阵列（MEAs）、全细胞膜片钳等，可用于测量细胞膜电位、神经元
的电活动等。但由于水凝胶的存在可能会阻碍电信号的传导，给电生理学分析带来挑战，目前一些研究通过将构建体直接打印在 MEAs 上或使用具有导电性的聚合物来解决这一问题。

3.6 3D 生物打印的应用

1. 疾病建模：3D 生物打印技术能够生成多种与大脑相关的细胞类型，并将它们共培养在特定的水凝胶配方中，以模拟人类大脑的某些方面，为研究神经发育障碍和神经退行性疾病提供了重要工具。例如，Yan 等人构建的多层神经组织模型，通过水平堆叠不同类型的神经元和星形胶质细胞，促进了突触形成，成功模拟了 Alexander 病等神经退行性疾病的病理过程。Rueda - Gensini 等人构建的帕金森病（PD）模型，整合了神经免疫相互作用，复制了 PD 的关键病理特征，如 α - 突触核蛋白聚集、线粒体功能障碍和氧化应激。对于 GBM 这种恶性脑癌，3D 生物打印模型能够更好地模拟其复杂的肿瘤微环境，包括肿瘤血管生成、缺氧环境等，为研究药物疗效和开发新的治疗策略提供了更有效的平台。
2. 药物发现：与 2D 模型相比，3D 生物打印模型能更准确地预测药物疗效和毒性，为临床前药物测试提供了更优的策略。3D 生物打印模型还可以定制为包含患者特异性细胞，实现个性化药物测试，并且能够与高通量筛选技术相结合，加速药物开发过程，同时减少对动物测试的依赖。然而，目前大多数研究主要集中在构建体的开发和验证上，对治疗药物在这些复杂系统中的疗效探索较少。研究表明，一些药物在 2D 和 3D 环境中的效果存在差异，3D 模型能够更真实地反映药物在体内的反应，为优化新药提供了有价值的参考。
3. 组织再生：尽管本文主要关注神经脑组织，但 3D 生物打印在神经组织再生方面也具有重要应用潜力。在周围神经损伤治疗中，3D 生物打印可以精确制造仿生支架，支持神经细胞的生长和分化，促进神经功能的恢复。对于脊髓损伤的治疗，虽然面临着挑战，但 3D 生物打印技术有望通过构建精确的轴突连接结构，推动脊髓再生的研究和治疗进展。

4. 结论与展望

本文系统回顾了过去十年 3D 生物打印神经组织的研究进展，涵盖了多种生物墨水、细胞类型以及在大脑、脊髓、肿瘤等模型构建和疾病建模、药物筛选、组织再生等方面的应用。研究发现，目前的研究在方法学透明度、材料表征标准化以及与药物发现的转化相关性等方面存在不足。
为了进一步推动该领域的发展，需要提高研究方法的透明度，详细说明表征技术的频率和条件等。同时，应标准化材料表征方法，全面评估 3D 生物打印神经组织模型的物理和生化性能，包括机械性能、细胞活力、蛋白质表达等方面。此外，3D 生物打印模型在药物筛选中的应用具有巨大潜力，通过整合患者特异性细胞和高通量筛选技术，可以更有效地识别潜在药物，加速药物开发过程。然而，目前 3D 生物打印技术在模拟血脑屏障等复杂结构方面仍面临挑战，需要探索新的方法和技术来实现更精确的建模。
新兴的研究方向，如生物信息学、机器学习和人工智能（AI）在 3D 生物打印中的应用，有望为理解疾病病理和优化模型提供新的工具和视角。未来，3D 生物打印神经组织模型的发展应注重模拟大脑的功能复杂性和结构层次，评估与体内条件的转化相关性，以解决复杂的疾病病理和治疗问题，为神经科学研究和临床应用带来新的突破。