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本文综述了荧光寿命成像（FLIm）在药物递送研究中的应用，涵盖技术原理、生物应用及仪器进展。
荧光寿命成像（FLIm）技术概述
荧光寿命成像（FLIm）作为一种动态成像工具，相较于传统荧光成像仅获取强度和光谱信息，它能实现真正的功能性 5 维时空数据采集（包括 x、y、z、时间和发射寿命）。FLIm 基于测量外源性和内源性光致发光材料的光致发光衰减时间（通常表示为 τ），其涉及的光致发光过程包括荧光和磷光。荧光是指发射体从激发态通过直接自旋守恒跃迁回到基态并伴随光子发射的过程，其激发态寿命较短，以纳秒为单位；而磷光则是当从激发态到基态的跃迁为自旋或宇称禁阻时，激发态寿命较长，从微秒到毫秒甚至更长。
测量荧光寿命的方法主要分为时域和频域系统。时域寿命采集通过对激发脉冲后的发射衰减轨迹进行采样，其中最广泛使用的是时间相关单光子计数（TCSPC）系统，它适用于低光子预算，时间分辨率高，但图像采集速度相对较慢。频域寿命采集则依赖于发射信号相对于周期性激发的相移和 / 或幅度衰减来计算寿命值，其成像速度快，但光学切片性能较差。此外，扫描式和宽场式图像采集也是 FLIm 的重要方面，各有优缺点。
荧光分子的发射寿命受多种因素影响，如与靶标的结合、环境中的淬灭剂、粘度、温度、pH 值、氧化还原电位和极性等。这些因素会改变荧光分子的辐射（kr）与非辐射（knr）速率平衡，从而导致寿命变化。例如，当荧光分子与靶标结合抑制了其旋转和振动自由度时，可能会增加寿命；而在存在淬灭剂的情况下，结合靶标对寿命的影响则取决于靶标相关淬灭与环境相关淬灭的效率。
FLIm 在药物研发与评估中的应用
在药物研发过程中，FLIm 可用于研究药物的时空分布、载体设计、药物递送途径及靶向结合等方面。
对于模型药物的时空分布研究，FLIm 常用于测量药物在细胞和组织中的分布、随时间的变化以及药物代谢产物，即药代动力学研究。例如，抗癌荧光药物阿霉素（Dox）与 DNA 相互作用时，在溶液和细胞核中的荧光寿命不同，且在细胞质、代谢或纳米载体封装时寿命也会发生变化。通过 FLIm 可观察到 Dox - Cu 复合物在活细胞中的动态过程，包括快速进入细胞、释放游离 Dox 以及向细胞核的转运。此外，光敏剂（PS）在光动力疗法（PDT）中的应用也可通过 FLIm 研究其细胞内分布和疗效，PS 产生的活性氧物种（ROS）会增加非辐射弛豫速率，导致其自身 τ 减小。
在载体 / 复合材料设计方面，脂质纳米颗粒、胶束、聚合物载体等药物递送系统的研究中，FLIm 发挥了重要作用。以脂质纳米颗粒为例，通过 FLIm 可研究脂质体中药物的存在形式，如 Dox 在标准 Doxoves? 配方中有结晶、游离和结合到脂质体膜三种形式，且不同形式的 Dox 荧光寿命不同。研究发现脂质体药物的稳定性和行为高度依赖于周围介质，这对其治疗效果有重要影响。同样，胶束和聚合物载体的相关研究也表明，FLIm 能够深入了解这些载体的结构和动力学，以及药物在其中的释放和代谢情况。
在药物递送途径和影响因素研究中，FLIm 可用于探究细胞穿透肽（CPP）与细胞膜的相互作用。例如，研究发现低浓度的 TP10（一种 CPP）可在不显著破坏细胞膜的情况下内化进入细胞，而高浓度时则会导致膜破坏和孔形成。此外，FLIm 还可研究共因子对药物递送的影响，如二甲基亚砜（DMSO）对模型脂质膜水动力学的影响，以及石墨烯量子点（GQD）对化疗药物道诺霉素（DN）跨膜转运的促进作用。在核酸递送方面，FLIm 可用于研究 pH 响应系统对治疗性反义寡核苷酸（ASO）内体逃逸的作用，如 DELVR 系统能够有效促进 ASO 释放，通过 FLIm 可监测这一过程。
在药物靶向和结合研究中，FLIm 结合 F?rster 共振能量转移（FRET）可用于评估药物与靶标的结合亲和力和动力学。例如，通过将 FLIm 集成到高通量自动化筛选试验中，可识别和评估蛋白质 - 蛋白质相互作用，通过监测供体荧光团的 τ 变化来确定蛋白质相互作用的强度，并进一步量化 FRET 效率以获得结合伴侣的解离常数。
在监测药物效果方面，FLIm 可通过测量 τ 变化来研究药物作用机制。例如，研究非甾体抗炎药双氯芬酸（DCF）从电纺聚 - L - 乳酸（PLA）支架的控释过程中，通过监测人真皮成纤维细胞的代谢变化（以内源性荧光团还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 NAD (P) H 的荧光寿命变化为指标），发现 DCF 的控释对细胞代谢有重要影响。此外，FLIm 还可用于监测药物诱导的 pH 变化，如通过工程化的 pH 敏感蛋白 mApple 来精确测量亚细胞环境的 pH 值，研究药物对细胞内 pH 的影响。
FLIm 在疾病诊断和治疗中的应用
FLIm 在疾病诊断和治疗领域有着广泛的应用，可用于多种疾病的诊断、病理研究和治疗监测。
在疾病诊断和评估方面，对于神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（AD），可利用近红外荧光团 ZW800 - 1C 结合 FLIm 检测淀粉样 β 聚集物和神经原纤维缠结，其与这些病变结合后荧光寿命会显著增加。在癌症诊断中，FLIm 可利用 pH 敏感探针、代谢探针等区分恶性和良性组织。例如，pH 敏感探针 PLN 可根据荧光寿命区分肿瘤细胞和正常细胞，且在肿瘤组织中，其荧光寿命会随着肿瘤内部酸度的增加而降低。此外，FLIm 还可通过测量 NAD (P) H 的荧光寿命来评估癌症细胞的代谢状态，为癌症诊断和治疗提供重要信息。在心血管疾病方面，FLIm 可用于测量血管内斑块的自发荧光寿命特征，以预测巨噬细胞泡沫细胞和细胞外脂质含量，从而对动脉粥样硬化病变进行表征。
在病理研究方面，FLIm 可用于研究代谢改变、免疫反应和神经元信号传导等过程。在代谢改变研究中，以糖尿病为例，FLIm 可监测糖尿病小鼠器官（如肝脏）中的代谢和氧化变化，发现糖尿病肝脏组织中 NAD (P) H 的自发荧光信号降低，且荧光寿命缩短，表明存在病理变化和缺氧。在免疫反应研究中，FLIm 可用于可视化人类皮肤肥大细胞的状态，通过检测其自发荧光特征，发现静息肥大细胞和激活肥大细胞的荧光寿命和强度存在差异，有助于对相关疾病的诊断和研究。在神经元信号传导研究中，FLIm 可用于实时可视化神经元中的离子瞬变，如通过使用细胞内钠离子（Na?）指示剂 ING2 和钙离子（Ca2?）敏感荧光探针，研究神经元在缺血条件下的离子稳态和信号传导机制。
在治疗监测方面，FLIm 可用于评估治疗干预的效果。例如，在炎症和感染研究中，通过抑制斑马鱼模型中的糖酵解，观察到 NAD (P) H 的平均寿命降低，表明代谢活性降低，且随着组织修复的进行，巨噬细胞的代谢活性增加。在免疫疗法中，FLIm 可用于监测 T 细胞的激活状态，通过测量 NAD (P) H 和 FAD 的自发荧光寿命，发现激活的 T 细胞与静止的 T 细胞在荧光寿命上存在显著差异。在癌症治疗中，FLIm 可用于研究癌细胞对化疗药物的代谢响应，如发现 p53 蛋白可调节顺铂处理的肺癌细胞的代谢，增加氧化磷酸化，提高癌细胞对化疗的敏感性。
寿命工程纳米材料及其应用
分子探针在 FLIm 应用中存在一些局限性，如易光漂白、发射光谱有限、荧光寿命范围窄且受微环境影响大等。相比之下，光致发光纳米材料具有更优异的性能，如更高的光稳定性、可调节的发射光谱和寿命，且对微环境不敏感。
寿命工程纳米材料可根据其光致发光机制和可实现的发射寿命进行分类，主要包括激子纳米结构、金属掺杂纳米晶体和荧光染料标记的纳米颗粒等。激子纳米结构通过电子从价带跃迁到导带形成电子 - 空穴对，其寿命可通过钝化核心表面和屏蔽环境来调节，典型代表如量子点和荧光金纳米颗粒。金属掺杂纳米晶体可分为两类，一类是掺杂过渡金属离子的晶体，其寿命工程方法包括改变掺杂比例、晶体宿主等；另一类是镧系掺杂的敏化剂 - 激活剂纳米颗粒（LnNPs），其应用广泛，可通过控制多种因素来调节寿命。荧光染料标记的纳米颗粒的荧光寿命由染料分子决定，通过基质修饰可调节寿命，且易于表面功能化，可用于联合诊断和治疗应用。
这些纳米材料在传感生理微环境和监测药物效果方面具有重要应用。例如，量子点和碳点可设计为对 pH 敏感的传感器，用于监测细胞内过程和药物效果，还可用于直接检测特定药物或活性分子，如碳纳米管耦合 DNA 用于多巴胺传感，量子点修饰硼酸用于葡萄糖检测。贵金属纳米簇可用于研究药物释放，如明胶包被的荧光金纳米颗粒用于监测 Dox 的释放。金属掺杂的 NPs，尤其是镧系掺杂的上转换纳米颗粒（UCNPs），可用于生物成像、诊断和监测药物递送，还可作为温度指示剂和用于超分辨率成像。
此外，寿命工程纳米材料在多路复用成像和跟踪药物递送方面具有独特优势。传统显微镜的多路复用受荧光光谱重叠的限制，而 FLIm 通过利用荧光寿命作为额外的维度，可实现更高的多路复用能力。例如，镧系掺杂的 NIR - II 纳米颗粒、tau - ruby 等材料已被用于体内诊断和多路复用成像，能够同时可视化和跟踪多个生物分子或细胞靶标。
FLIm 仪器和方法的进展
FLIm 在药物递送研究中的应用需要合适的仪器和方法，以满足对荧光和磷光药物、载体及传感诊断剂的测量需求。
在技术方面，FLIm 系统设计需考虑多种因素。对于短寿命（100 ps - 20 ns）荧光药物的 FLIm，技术要求较高，依赖于昂贵的具有亚纳秒分辨率的光电探测器或执行器；而对于体内 FLIm，由于生物组织对 UV / 可见光的穿透性差和自发荧光强等问题，长寿命（10 μs - 10 ms）物种或颗粒更具优势，尤其是在 NIR - II 光谱范围内，可增强组织穿透性，但目前 NIR - II FLIm 系统对先进红外光电探测器的依赖且难以实现纳秒级单光子灵敏度。在图像采集速度方面，宽场式 FLIm 采集速度快，但光学切片性能差；扫描式 FLIm 虽然采集速度慢，但具有光学切片、高信噪比和高空间分辨率的优势，且与超分辨率显微镜结合可实现亚衍射分辨率成像。此外，FLIm 还可与其他光学成像模态集成，如内窥镜、光学相干断层扫描等，以实现中尺度和宏观尺度的应用，但这也会增加系统复杂性并可能牺牲部分 FLIm 性能。
主要的 FLIm 技术包括时间相关单光子计数（TCSPC）、时间门控 FLIm、条纹 FLIm 和频域 FLIm。TCSPC 是应用最广泛的 FLIm 实现方式，适用于低光子预算应用，但存在光谱范围受限和成像速度慢的问题。时间门控 FLIm 能够快速有效地抑制干扰背景，增强图像对比度，尤其适用于长寿命磷光探针，但存在光子浪费和时间分辨率有限的问题。条纹 FLIm 适合捕捉超快事件，可用于研究蛋白质动力学和温度监测等。频域 FLIm 兼容宽场成像模式，成像速度快，但在光子效率、降噪和采集速度方面有待提高，且容易受到荧光背景的影响。
FLIm 信号处理算法对于提高测量精度和利用有限的光子预算至关重要。现有算法可分为非全局和全局方法，以及参数和非参数方法。非全局方法以像素为单位进行分析，而全局方法则考虑整个图像的空间相关性。参数方法旨在提取寿命值，如最小二乘法和最大似然法，后者更适用于低光子计数情况。非参数方法如相量法，避免了曲线拟合，能够快速处理信号，但对发射衰减形状敏感，容易受到激光脉冲形状和高背景的影响。此外，还有多种其他数据分析算法，如拉普拉斯变换、拉盖尔反卷积和主成分分析等，但目前尚无一种方法能完美满足所有实验需求。
FLIm 与其他光学成像模态的结合为其临床应用提供了更广阔的前景。例如，FLIm 与内窥镜结合可用于检测组织内源性荧光，监测药物对组织表面或腔内病变的治疗效果；荧光寿命成像眼底镜（FLIO）可用于检测视网膜的代谢状态，有助于早期诊断年龄相关性黄斑变性（AMD）；光学相干断层扫描（OCT）与 FLIm 结合可提供生物组织的功能状态评估；光片照明与 FLIm 结合可实现体内三维体积成像。此外，FLIm 系统还可与临床光学诊断系统集成，如在神经外科手术中，通过手持光纤探针实现组织自发荧光的激发和采集，并结合增强现实技术辅助手术操作。
结论与展望
在过去十年中，FLIm 已从实验室的小众技术发展成为药物递送研究中的重要工具。它在药物研发、疾病诊断和治疗监测等方面发挥着重要作用，随着探针设计、仪器和算法的不断进步，其应用前景将更加广阔。
然而，FLIm 技术仍面临一些挑战。在荧光发射方面，虽然纳米材料在寿命工程和发射增强方面有一定优势，但仍需进一步探索如何在更多情况下实现两者的协同。在测量方面，由于寿命测量比强度测量复杂，需要对用户进行充分培训，以避免实验误差，同时要深入研究寿命变化的精确机制，确保结果的准确解读。此外，还需关注荧光标记对药物药代动力学的影响，比较不同标记方式下药物的生物分布。
随着仪器技术的不断发展，FLIm 与其他生物医学成像模态的结合将更加紧密，为临床实践提供更多互补和交叉验证的信息。机器学习等技术的应用也将有助于提高 FLIm 的测量精度、效率和标准化程度。未来，FLIm 有望在实时诊断和开发更有效的治疗各种疾病的药物方面发挥更大的作用，为生命科学和健康医学领域带来新的突破。
