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为解决蛋白质结构变化分析及整合蛋白质丰度和构象定量研究的不足，来自中国的研究人员开展 PACA 技术研究，确定了 LPS 刺激小胶质细胞后不同响应类型的蛋白质，有助于揭示调控机制。
在生命科学研究领域，大量研究聚焦于疾病相关表型中蛋白质丰度的变化，却较少关注蛋白质结构变化的分析，同时对整个蛋白质组中蛋白质丰度和构象进行同步定量的研究更是少之又少。为填补这一空白，研究人员引入了一种方法 —— 蛋白质丰度和构象分析（Protein Abundance and Conformation Analysis，PACA），它能全面展现生物过程中蛋白质的变化情况，这种双重分析方法有助于更深入理解蛋白质功能及其在细胞动态变化中的作用。
传统上，蛋白质丰度变化分析常采用基于串联质谱标签（tandem mass tag，TMT）的定量蛋白质组学技术，它具备高通量和高定量精度的优势。然而，由于现有方法存在局限性，检测整个蛋白质组的构象变化颇具挑战。像 X 射线晶体学（X-ray crystallography）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等传统技术，在研究分离的蛋白质结构时效果显著，但在复杂细胞环境中捕捉结构变化就不太适用。虽然荧光共振能量转移（F?rster resonance energy transfer，FRET）和细胞内 NMR 等技术可监测细胞内单个蛋白质的构象变化，不过它们依赖特定标记策略，限制了在大规模、全蛋白质组研究中的应用。
目前，基于质谱（mass spectrometry，MS）的化学共价标记策略在研究蛋白质结构和构象变化方面愈发重要。其中，赖氨酸二甲基化标记因标记效率高、对蛋白质结构扰动小而备受关注。已有多种技术用于监测动态构象变化，如两步同位素标记 - 赖氨酸反应性分析（two-step isotope labeling-lysine reactivity profiling，TILLRP）和赖氨酸反应性分析 - 质谱（lysine reactivity profiling-mass spectrometry，LRP-MS），但这些方法通常仅适用于纯化蛋白质。共价蛋白质染色（covalent protein painting，CPP）技术将赖氨酸二甲基化应用于脑裂解物和活细胞，以检测错误折叠的蛋白质，可它的肽段覆盖范围有限。而反向检测反应性氨基酸分析（Reactive Amino Acid Profiling with Inverse Detection，RAPID）策略虽提高了可扩展性，但在准确量化天然与标记肽段比例方面存在困难。这些局限表明，需要更强大的方法在天然细胞环境中实现高通量构象分析。
靶标响应可及性分析（Target-Responsive Accessibility Profiling，TRAP）是一种化学蛋白质组学方法，利用二甲基化标记追踪配体结合后全蛋白质组赖氨酸可及性的变化，有助于发现配体 - 靶标。此外，TRAP 还能揭示构象变化，比如丙酮酸激酶 M2（pyruvate kinase M2，PKM2）的变构激活剂 TEPP-46 的研究就是例证，它能检测到人类蛋白质组中约 60% 赖氨酸残基的可及性。TRAP 最初用于细胞裂解物研究，如今有望在多种病理生理条件下对活细胞进行原位构象分析。于是，研究人员将传统定量蛋白质组学与基于 TRAP 的构象分析相结合，推出了 PACA 技术。在活细胞中，TRAP 利用同位素甲醛（CD2O）和硼烷 - 吡啶络合物（borane-pyridine complex，BPC）选择性标记溶剂暴露的赖氨酸，捕捉动态结构变化，同时运用标准蛋白质组学流程定量蛋白质丰度，从而全面呈现蛋白质的变化情况。
为系统分类 PACA 捕捉到的蛋白质组响应，研究人员定义了四类：仅丰度发生变化的丰度响应蛋白（Abundance Responders，AR）；构象改变但丰度不变的结构响应蛋白（Structural Responders，SR）；丰度和结构都发生改变的共同响应蛋白（Co-Responders，CoR）；以及无明显变化的无响应蛋白（Non-Responders，NR）。研究人员将 PACA 技术应用于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小胶质细胞激活实验，共鉴定出 49 个 AR 蛋白、82 个 SR 蛋白、4 个 CoR 蛋白和 4045 个 NR 蛋白。AR 蛋白主要参与炎症反应，SR 蛋白在信号转导和变构调节方面更为丰富。尽管 CoR 组数量较少，但其中的蛋白却是免疫激活过程中协调结构和丰度变化的关键调节蛋白。这些研究结果突显了 PACA 技术在剖析复杂蛋白质组动态变化、揭示调控机制方面的强大能力。
实验中，BV2 小鼠小胶质细胞在添加 10% 胎牛血清（FBS，南美来源）、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的杜氏改良伊格尔培养基 / 营养混合物 F-12（DMEM/F12）中，于 37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养。评估小胶质细胞激活时，将 BV2 细胞以 8×104个细胞 / 孔的密度接种于 12 孔细胞培养板，培养 24 小时后，用 10 ng/mL 或 100 ng/mL 的 LPS 进行孵育。通过用 LPS 刺激 BV2 小胶质细胞建立模型，证实短期 LPS 处理（10 或 100 ng/mL）能引发快速炎症反应，表现为 Il6、Il1b 和 Tnfα 表达增加以及 IL-1β 分泌升高，随后开展 PACA 技术检测实验。
综上，本研究引入 PACA 技术并应用于系统评估 LPS 刺激后小胶质细胞中蛋白质丰度和结构变化，发现 AR 蛋白主要介导免疫反应，SR 蛋白涉及代谢、蛋白质折叠和翻译过程，CoR 蛋白可能与炎症调节密切相关。这些发现强调了整合蛋白质丰度和结构研究的重要性。
