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为解决传统抗药抗体（ADA）检测方法的缺陷，来自赛诺菲（Sanofi）的研究人员开发了杂交免疫捕获 - 液相色谱 - 串联质谱（IC-LC-MS/MS）技术，该技术能检测、分型和半定量 ADA，有助于更好理解 ADA 对生物疗法药代动力学的影响。
治疗性蛋白质常常会引发涉及抗药抗体（ADAs）的免疫反应。这些抗体会与药物形成复合物，通过两种机制降低药物疗效：一是增加药物清除率，二是干扰药物与靶点的相互作用。在潜在生物疗法药物开发的临床阶段，评估其产生中和性和非中和性抗药抗体的免疫原性风险至关重要。在临床前阶段进行这种评估，也有助于解释药代动力学（PK）问题，但现有的动物模型对预测人体反应的准确性并不高。
目前已使用多种检测方法来检测抗药抗体，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射免疫测定和基于电化学发光（ECL）的技术等。在开发早期，最常用的检测 ADA 的方法是使用抗物种抗体作为检测试剂的直接 ELISA 测定；在后期则是使用 Meso Scale Discovery（MSD）平台的桥接测定。然而，传统免疫测定会受到特异性和选择性问题的困扰，特别是受到循环药物或可溶性药物靶点的干扰。
为解决这些问题，研究人员开发了一些涉及免疫复合物解离的检测方法。不过，虽然这些方法通常能提高对药物和靶点的耐受性，但在诸如酸性处理等严苛的样品处理条件下，ADAs 可能会发生降解。这种处理可能会影响 ADAs 的结合能力，进而影响对含量最少或亲和力最低的 ADAs 的检测。此外，尽管配体结合分析（LBA）测定可以检测 ADA 的所有同种型，但无法同时评估免疫反应产生的所有特定同种型。值得强调的是，ADA 的同种型特征分析非常有用，尤其是在发生超敏反应或评估新出现的免疫反应成熟度时。根据美国食品药品监督管理局（FDA）对免疫原性检测的建议，对于非粘膜给药途径且无过敏风险的情况，相关的 ADA 同种型是 IgM 和 IgG；对于粘膜给药途径，IgA 同种型的 ADAs 也很重要；对于有高过敏风险或已观察到过敏反应的治疗性蛋白质产品，IgE 同种型 ADAs 的特征分析可能很有意义。
另外，虽然 LBA 测定可以通过对 ADA 阳性样本进行系列稀释来滴定总 ADAs，但无法对这些 ADAs 进行定量测量。LBA 测定的另一个问题是生物分析方法之间存在差异。目前普遍认为，由于所使用的生物分析方法性能不同，无法比较不同生物制品的免疫原性。而且，由于缺乏真正的参考标准，无法确定测定的真正灵敏度，所报告的测定灵敏度取决于所使用的阳性对照。
总之，目前缺乏一种能够对所有可能影响药代动力学 / 药效学（PK/PD）和安全性的 ADA 同种型进行特征分析、定量、通用且多重检测的方法，且该方法能适用于不同的生物疗法。最近，杂交免疫捕获 - 液相色谱 - 串联质谱（IC-LC-MS/MS）技术被开发出来，作为临床前和临床开发中 ADA 分析的补充工具。IC-LC-MS/MS 技术结合了免疫捕获和液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS），能够识别和半定量 ADAs 的特定同种型和亚类。该方法已用于检测猴子毒理学研究中生物疗法诱导的 ADAs，以及检测人血浆中针对内源性治疗性蛋白质的预先存在的 ADAs。此外，IC-LC-MS/MS 技术能够显著减少可溶性靶点的干扰，还可能提高对药物的耐受性。由于每只动物或每位患者的 ADAs 都是多克隆的，其互补决定区（CDR）可能不同，因此不存在能明确代表体内 ADA 反应的通用定量标准，所以只能采用半定量方法。半定量分析应通过分析所有 ADAs 共有的肽段来进行，即位于每种抗体同种型恒定区的肽段。这种方法可以使用 “市售” 的每种同种型免疫球蛋白（Ig）作为标准，提供一种半定量且通用的检测方法，可用于多个项目。然而，使用位于恒定区的肽段带来了额外的分析挑战，即如何区分 ADAs 和内源性免疫球蛋白（Ig）。一个主要的分析挑战是找到一种免疫捕获方法，能够在不受内源性 Ig 干扰的情况下对总 ADAs 进行定量。免疫捕获方法应满足以下标准：一是应特异性用于 ADA 测量；二是应适用于支持不同的生物疗法；三是一旦方法建立，应便于在常规分析中使用。
在一项初步工作中，研究人员对 Chen 等人引入的 IC-LC-MS/MS 工作流程进行了优化，用于分析临床前研究的样本，即对静脉输注含人 Fc 片段的蛋白质药物后的猴子进行重复给药毒理学研究的样本。
本研究的创新之处在于，运用并改进了临床前研究中开发的杂交方法，对临床样本中的 ADAs 进行半定量分析，并对免疫反应中涉及的所有同种型进行特征分析。
研究人员将免疫捕获方法应用于一项单剂量递增的临床研究，该研究此前已使用 LBA 方法（PandA 测定）测量过 ADAs。研究人员开发出了能够检测和半定量所有 ADA 同种型的 IC-LC-MS/MS 测定方法。除了测量 IgG 亚类和 IgM ADAs 外，还测量了药物过敏反应后产生的 IgE 同种型 ADAs。测量 IgE 同种型 ADAs 带来了额外的分析挑战，因为这种同种型通常约占总 ADAs 的 0.5%，其在人血清中的浓度应处于高皮克（pg）至低纳克（ng）/ 毫升的范围。
研究使用来自法国圣格雷瓜尔 Biopredic International 公司的健康供体人血清，用于每种 IgG 亚类和 IgE 同种型的校准曲线绘制以及作为空白样本；使用该公司的兔血浆用于 IgM 同种型的校准曲线绘制。实验性治疗蛋白由赛诺菲（Sanofi）提供，并由法国拉费尔泰圣奥班的 Agrobio 公司进行生物素化处理，平均生物素 / 蛋白质比率为 3.6，在 1X 磷酸盐缓冲液（PBS，137mM）中配制成 1mg/mL 的等分试样。
在临床前研究的初步工作（未发表数据）中，第一种用于分析临床前研究样本的免疫捕获方法是使用生物素化药物作为试剂直接捕获 ADAs。这种方法应用广泛，实施起来最简单，且可用于任何生物疗法，无论其结构如何。不过，该方法可能会受到循环药物的影响，循环药物会与生物素化药物竞争捕获 ADAs。但潜在地，IC-LC-MS/MS 技术受干扰的影响可能较小。
使用生物素化药物作为捕获试剂的 IC-LC-MS/MS 测定方法，能够在临床试验的人血清样本中检测、分型和半定量 IgG ADA 亚类以及检测 IgM 同种型 ADAs，并且与 LBA PandA 测定结果吻合良好。同种型分析为表征免疫反应提供了额外信息，有助于更好地理解 ADAs 对生物疗法药代动力学的影响。
