一种高灵敏度 HPLC-FD 法测定培米替尼（PGT）血浆浓度及药代动力学研究

《Analytical Biochemistry》：A sensitive HPLC method with fluorescence detection for quantification of pemigatinib in human plasma samples and its in-vivo application to pharmacokinetic study in rats

为解决培米替尼（PGT）现有分析方法的不足，沙特研究人员开发 HPLC-FD 法，可精准测定其血浆浓度。

　　培米替尼（PGT）属于激酶抑制剂类小分子，化学名称为 3-(2,6 - 二氟 - 3,5 - 二甲氧基苯基)-1 - 乙基 - 8-(吗啉 - 4 - 基甲基)-1,3,4,7 - 四氢 - 2H - 吡咯并 [30,20:5,6] 吡啶并 [4,3-d] 嘧啶 - 2 - 酮，分子式为 C₂₄H₂₇F₂N₅O₄ ，分子量为 487.5g/mol。2020 年 4 月 17 日，美国食品药品监督管理局（FDA）批准 PGT 用于治疗与成纤维细胞生长因子受体 2（FGFR2）基因突变相关的难治性、不可切除的胆管癌（CCA）。CCA 是一种罕见但致命的癌症，主要影响胆管上皮细胞（胆管细胞），还可能影响胆道其他部位和肝实质。由于原发性致病疾病和发病部位不同，CCA 具有异质性，这使得它侵袭性很强。不同的 CCA 亚型与基因变异有关，携带 FGFR2 的 CCA 可以用靶向 FGFR 抑制剂治疗。鉴于临床试验取得的良好结果以及疾病的侵袭性，PGT 治疗 CCA 的审批流程得以加速。2022 年 8 月 26 日，PGT 获批用于治疗与 FGFR1 重排相关的复发或难治性骨髓 / 淋巴肿瘤（MLNs）。市面上的 PGT 以 Pemazyre? 口服片剂（4.5mg、9mg 或 13.5mg）的形式销售，由美国特拉华州威尔明顿的英赛特公司（Incyte Corporation）生产。PGT 推荐临床剂量为 13.5mg，它通过抑制 FGFR1、2 和 3 的活性，进而抑制癌细胞增殖的激酶信号通路发挥作用，在体内和体外实验中均观察到了这种抑制效果。有趣的是，在相似的半数抑制浓度（IC₅₀≤1.4nM）下，PGT 对 FGFR4 的抑制活性明显低于其他 FGFR 受体，达到与抑制 FGFR1 - 3 相似的效果则需要 15nM 的 IC₅₀ 。

尽管 PGT 有治疗益处，但它也存在一些副作用和健康风险。常见的不良反应包括高磷血症、胃肠道问题（恶心、腹泻）、疲劳、皮肤问题（皮肤干燥、脱发）、食欲下降、眼部毒性（干眼症、视网膜疾病）以及肌肉骨骼疼痛。严重风险包括视网膜脱离、高磷血症相关并发症（软组织钙化、肾功能损害）、肝毒性、肾功能障碍、胚胎 - 胎儿毒性、感染风险增加和心律失常。临床管理需要定期监测磷酸盐水平、肝肾功能和眼部健康，同时调整剂量并对患者进行教育以确保安全。因此，使用 PGT 需要谨慎监控，降低潜在风险。

PGT 治疗的有效性和安全性取决于其剂型（Pemazyre? 口服片剂）的质量以及治疗过程中对患者血浆浓度的评估。文献调研发现，已有一些分析方法用于测定 Pemazyre? 片剂中的 PGT，比如微孔荧光分光光度法辅助荧光酶标仪法；还有用于测定大鼠血浆中 PGT 的液相色谱 - 串联质谱法（LC-MS/MS），以及用于测定实验室混合物中 PGT 稳定性的高效液相色谱 - 光电二极管阵列法，还有通过 LC-MS/MS 评估其在人肝微粒体中代谢稳定性的方法。之前开发的 LC-MS/MS 方法能够评估 PGT 的药代动力学（PK）特征，但该方法的不精密度高达 13.3%。此外，LC-MS/MS 虽然选择性和灵敏度高，但在分析方法广泛应用时，其设备可及性、高昂成本和操作复杂性是需要考虑的主要缺点。而且，这些方法都未经验证可用于测定人血浆中的 PGT。因此，迫切需要开发一种经济实惠、灵敏、选择性好、相对快速且绿色的分析方法，用于在临床和质量控制中准确测定人血浆中的 PGT，并适用于 PK 分析。

荧光技术是强大的科学工具，广泛且有效地应用于医学、药学和生物技术等领域，用于检测和定量不同样品基质中的各种分析物。特别是高效液相色谱 - 荧光检测器法（HPLC-FD），由于多种原因可作为 LC-MS-MS 的替代方法。与 LC-MS/MS 相比，HPLC-FD 灵敏度和准确度高、成本更低，色谱条件和检测参数易于优化。然而，目前还没有使用 HPLC-FD 测定人血浆和大鼠血浆中 PGT 的方法。

在本研究中，研究人员开发了一种全新的 HPLC-FD 方法，用于测定人血浆中的 PGT 并确定其药代动力学特征。经过优化方法条件，结果显示该方法在定量血浆样本中的 PGT 时，具有高灵敏度、选择性和可靠性。

实验材料方面，PGT 和分析级标准物质 SEL 购自美国沃本的 LC Laboratories 公司，纯度大于 99%。使用的是美国安捷伦（Agilent）公司（加利福尼亚州圣克拉拉）生产的 Zorbax Eclipse Plus C18 色谱柱（150mm×4.6mm 内径，5μm 粒径），连接德国杜伦的马赫雷 - 纳格尔公司（Macherey-Nagel GmbH & Co.）生产的保护柱。HPLC 级甲醇和乙腈（99.9%）购自德国达姆施塔特的默克公司（Merck），纯度≥98.9% 的分析级醋酸铵也已获取。

本研究选择 PGT 进行研究，是因为它作为近期获批治疗不可切除的 CCA 和 MLNs 的药物十分重要。开发一种精确、灵敏、快速且相对经济实惠的分析方法，对于准确分析血浆中 PGT 浓度、监测和评估其 PK 特征至关重要。这有助于优化其临床安全性和有效性、评估给药剂量是否合适并提高治疗效果，最终促进 PGT 的合理应用。

研究首次开发并验证了一种灵敏、快速、可靠且经济高效的 HPLC-FD 方法，用于定量测定血浆样本中的 PGT，并成功应用于药代动力学分析。该方法的特点是操作简单，样品制备无需萃取，仅需甲醇沉淀。通过等度洗脱模式和反相 HPLC，PGT 和 SEL 可在 10 分钟内实现色谱分离。

作者贡献声明：Sarah Alrubia 负责撰写初稿、方法验证、方法学研究、调查、正式分析和数据整理；Amsha S. Alsegiani 负责撰写初稿、方法验证、调查、正式分析、数据整理和概念构思；Nourah Z. Alzoman 负责撰写评审和编辑、可视化处理、方法学研究和获取资金；Ibrahim A. Darwish 负责撰写评审和编辑、监督、项目管理和方法学研究 。

数据可用性声明：作者确认支持本研究结果的数据在文章和 / 或其补充材料中均可获取。

利益冲突声明：作者声明不存在可能影响本文所报告研究工作的已知财务利益或个人关系。

致谢：作者感谢沙特阿拉伯利雅得的沙特国王大学（King Saud University）的研究人员支持项目（项目编号：RSP2025R215）为本研究提供资金支持。