酿酒酵母中尿囊素诱导表达系统：代谢工程的新利器

研究人员针对酿酒酵母基因表达调控局限，设计尿囊素诱导表达系统，有效调控代谢，助力低成本生产。

　　在生物技术蓬勃发展的今天，微生物细胞工厂成为生产各种生化产品和重组蛋白的 “热门选手”，其中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）凭借诸多优势脱颖而出。它不仅是首个基因组被完全测序的真核生物，有着丰富的实验数据积累，还是公认安全（GRAS）的微生物，具备易于遗传操作和进行翻译后修饰等优点，常被用于生产如柚皮素、香草醛和胰岛素等物质。

然而，酿酒酵母在实际应用中却遇到了 “拦路虎”。其常用的基因表达系统依赖组成型或半乳糖调节的启动子，可选择的调控方式有限，这大大限制了基于酿酒酵母的微生物细胞工厂的生产效率。像一些组成型强启动子，虽然能使酶大量表达，但在细胞生长早期可能产生不利影响，还会导致菌株不稳定。而碳源依赖的诱导调控系统，又容易受葡萄糖抑制，在有葡萄糖存在时，基因表达常常被 “按下暂停键” 。物理刺激调控方式，如光和温度调控，也存在各自的问题，光调控在高密度培养时穿透性不足、光照不均匀，难以应用于工业生产；温度调控虽有一定进展，但仍有优化空间。化学诱导剂虽应用广泛，但目前还缺乏针对酿酒酵母尿囊素利用相关基因（DAL 基因）的改造来用于生化生产的尝试。

为了突破这些困境，厦门大学的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们致力于设计和表征基于酿酒酵母内源性尿囊素分解代谢系统（DAL 相关基因）的尿囊素诱导表达系统，相关成果发表在《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》 上。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术，利用该技术对酵母基因组进行精准编辑，实现基因的删除和替换；其次是构建质粒和菌株，通过精心设计和构建含有特定基因片段的质粒，并将其导入酵母菌株，为后续研究奠定基础；此外，还运用了测量 OD₆₀₀和绿色荧光强度、高效液相色谱（HPLC）分析等技术来检测相关指标。

研究结果如下：

• 尿囊素诱导的 DAL 启动子的表征：研究人员发现，尿囊素在酿酒酵母正常生理条件下是嘌呤降解的中间产物，存储在液泡中。当其他氮源受限，它能被一系列酶分解为氨，为细胞生长供氮，还可作为诱导剂和氮源双重角色调控基因表达。研究人员选择 DAL2 和 DAL3 启动子，以增强绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因，比较它们在以尿囊素为氮源时的调控能力。实验显示，DAL2 启动子表现更优，在以尿囊素为氮源培养 48 小时后，EGFP 表达量比对照组高约 14.4 倍 ，DAL3 启动子也能被尿囊素激活，但激活下游基因表达的能力稍弱。同时，研究发现尿囊素可作为替代氮源支持酵母细胞增殖，不过 DAL2 受无义介导的衰变（NMD）影响，其 RNA 半衰期较短，这一现象对尿囊素诱导系统的影响还需进一步研究。
• 耦合 GAL 调控子的分层遗传设计提升尿囊素开关性能：虽然 DAL2 启动子的开 / 关比表现不错，但启动子强度仍较弱，直接用其控制基因表达效果欠佳。研究人员借鉴之前构建分层遗传电路的经验，对尿囊素诱导系统进行重新编程，构建了尿囊素 - GAL 开关。他们敲除 Gal80 基因，并用 DAL2 启动子替换 Gal4 基因的启动子，构建出 JS - Allan 菌株。实验表明，该开关能有效放大尿囊素输入信号，EGFP 信号输出值比直接用 DAL2 启动子控制基因表达高 6.8 倍。使用着丝粒复制起点的单拷贝质粒表达 EGFP 时，虽然 EGFP/OD₆₀₀的绝对值略有降低，但由于基础表达水平下降，开 / 关比进一步提高到 > 60，这对代谢工程应用十分有利。
• 利用尿囊素 - GAL 开关调控类胡萝卜素合成：β - 胡萝卜素（C₄₀H₅₆）在维持人体健康方面发挥着重要作用。研究人员将尿囊素 - GAL 开关导入已优化的产 β - 胡萝卜素的酿酒酵母菌株 JS - BE5 - PEST 中。结果显示，在含尿囊素的 YABD 培养基上培养 48 小时后，工程菌株 JS - BE5 - Allan 呈现明显橙色，而在 YNBD 培养基上则无此现象。摇瓶发酵 96 小时后，JS - BE5 - Allan 菌株在 YABD 培养基中 β - 胡萝卜素产量约为 80.0mg/L 。不过，该工程菌株在含尿囊素培养基中的生长速度比在正常氮源培养基中的慢，且在不含氨基酸的培养基中生长不佳，可能需要调整类胡萝卜素生物合成模块在基因组中的位置来进一步提升产量。
• 探索尿囊素 - GAL 开关用于条件性细胞絮凝：在发酵产品分离过程中，去除悬浮酵母细胞成本较高。细胞絮凝是一种便捷、经济的方法，酿酒酵母的 Flo1 蛋白在其中起关键作用。研究人员用 GAL1 启动子替换 Flo1 基因的启动子，构建出 JS - Allan P_GAL1:Flo1 菌株。实验发现，在 YABD 培养基中培养 24 小时后，该菌株细胞形成聚集体并沉淀，而在 YNBD 培养基中细胞仍保持悬浮状态，表明尿囊素 - GAL 开关可有效控制酵母细胞絮凝行为，满足工业生产需求。

研究结论和讨论部分指出，尿囊素既能作为氮源又能作为诱导剂，相较于受葡萄糖抑制的碳源依赖诱导调控系统，大大简化了发酵过程。研究人员优化的分层尿囊素 - GAL 系统，开 / 关比令人瞩目，超过了传统 P_DAL2控制的基因表达。该系统在 β - 胡萝卜素生产和酵母细胞条件性絮凝方面的成功应用，拓展了其在工业生产中的应用范围。不过，研究也存在一些有待进一步研究的地方，如 DAL2 受 NMD 影响的机制在工业环境中的作用，以及如何优化类胡萝卜素生产菌株在不同培养基中的生长等问题。总体而言，这项研究为酿酒酵母在生化产品和药物低成本生产方面开辟了新道路，有望推动代谢工程领域的进一步发展。