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为探究结核分枝杆菌基因功能，研究人员构建 CRISPR/Cas12a 系统，证实其可有效沉默耻垢分枝杆菌基因，意义重大。
结核病，这个有着百年历史的 “顽固分子”，自 1882 年被发现以来，一直威胁着全球人类的健康。它的致病菌结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）如同一个隐藏在暗处的敌人，不仅生长缓慢、传播能力强，还特别 “狡猾”，对基因改造有着很强的抵抗力，导致很多针对它的研究困难重重。比如，有效的疫苗至今难以研发出来，耐药菌株的出现更是让治疗雪上加霜。为了找到对抗它的有效方法，研究人员急需深入了解结核分枝杆菌的基因功能，找到潜在的疫苗或药物靶点，可传统的研究方法在面对这种 “棘手” 的细菌时却常常 “束手无策”。
在这样的困境下，来自 Bhabha Atomic Research Centre 等机构的研究人员展开了一项极具意义的研究。他们的成果发表在《Journal of Biological Engineering》上，为我们认识结核分枝杆菌提供了新的视角和有力的工具。
研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先是构建了基于死亡 Cas12a（dCas12a）的 CRISPR 干扰（CRISPRi）系统，通过特定的质粒构建方式，将相关基因整合到耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）中；其次利用 qPCR 技术来定量分析基因的表达情况；还运用了蛋白质免疫印迹（Western blot）来检测蛋白的表达；另外，通过生长曲线和斑点实验来评估基因敲低对菌株生长的影响；构建针对特定基因的敲低菌株进行异烟肼耐药性检测。
下面来看看具体的研究结果：
- CRISPR/Cas12a 系统的建立与测试：研究人员成功在耻垢分枝杆菌中建立了基于 CRISPR/Cas12a 的 CRISPRi 系统。这个系统由两个质粒组成，dCas12a 基因被克隆到整合质粒上，在诱导型启动子的控制下稳定整合到宿主细胞中；sgRNA 则通过另一个复制性质粒提供。实验证明，dCas12a 对耻垢分枝杆菌没有毒性，通过靶向已知的必需和非必需基因，发现该系统能够有效沉默基因，比如一些必需基因在诱导剂存在时存活率降低，同时利用 qPCR 也证实了部分基因的表达被有效抑制。
- dCas12a 靶向基因敲低的转化效率：研究人员参考结核分枝杆菌的必需基因数据库，尝试靶向耻垢分枝杆菌中 50 个同源基因，这些基因来自不同的功能类别。通过将设计好的靶向不同基因的间隔序列克隆到质粒中，转化含有 dCas12a 的菌株，根据在诱导剂存在与否的情况下转化效率的差异，判断基因是否 “脆弱”（vulnerable）。结果发现，不同功能类别的基因表现各异，在 45 个被研究的基因中，有 11 个基因敲低后显示存活率降低，4 个基因表现出菌落变小的现象。
- 固体琼脂和液体培养基中生长适应性的评估：研究人员通过斑点稀释实验和液体培养基中的生长曲线实验进一步评估基因敲低对菌株生长的影响。在斑点稀释实验中，45 个基因里有 15 个基因在诱导剂存在时生长受到抑制，这与之前转化效率实验的结果有一定的相关性，不过也有部分基因在两种实验中的表现存在差异。生长曲线实验结果与固体培养基实验结果基本一致，而且还发现了一些在固体培养基实验中未显示生长缺陷的基因，在液体培养基中却表现出明显的生长缺陷，这凸显了不同实验条件对评估基因功能的重要性。
在研究结论和讨论部分，此次研究意义非凡。一方面，研究人员通过实验证明了 CRISPRi 与 dCas12a 系统在识别和研究耻垢分枝杆菌必需基因方面的强大功能，它可以作为一种稳健、通用且易于使用的工具，用于功能基因组学研究。另一方面，研究还对比了 dCas12a - CRISPRi 和 dCas9-based CRISPRi 两种筛选方法，发现即使只研究 45 个基因，两者之间也存在有趣的差异。这表明单独研究突变体和基因敲低菌株的生长情况来评估适应性缺陷非常重要，因为高通量的筛选研究可能会遗漏一些必需基因。而且与已有的 dCas9 系统相比，dCas12a 具有诸多优势，比如更简单的间隔序列设计、更小的蛋白尺寸、更简单的克隆过程等。
总的来说，这项研究成功建立并评估了 CRISPR/Cas12a 系统在耻垢分枝杆菌中的基因沉默功能，为深入了解结核分枝杆菌的基因功能和开发新型抗结核药物提供了重要的技术支持和理论依据，在结核病研究领域具有重要的推动作用，为后续的研究开辟了新的方向。
