两种具有水产养殖噬菌体治疗潜力的强毒坎氏弧菌噬菌体

为解决水产养殖中弧菌病及抗生素滥用问题，研究人员评估两种噬菌体潜力，其有望用于防治弧菌病。

　　

一、研究背景

随着全球对海鲜需求的不断攀升，水产养殖业迅猛发展，养殖模式逐渐向高密度、大规模和集约化转变。然而，这也带来了一系列问题，其中水生动物疾病的频繁爆发成为制约水产养殖业发展的关键因素。在众多致病因素中，细菌感染是最为常见的类型，而弧菌属（Vibrio）细菌引发的疾病更是日益猖獗。

弧菌是一类嗜盐的革兰氏阴性菌，广泛分布于河口和沿海生态系统中，常被归类为机会致病菌。常见的致病性弧菌包括霍乱弧菌（V. cholerae）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）、副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）、坎氏弧菌（V. campbellii）和哈维氏弧菌（V. harveyi）等。它们能引发多种疾病，像致死性肝胰腺败血症、急性肝胰腺坏死病（AHPND）等，给全球的对虾养殖业造成了巨大损失。例如，Dong 等人从虾场分离出携带 pirip 基因的坎氏弧菌菌株，将虾浸泡在该菌株悬浮液中，12 小时内就出现典型的 AHPND 症状，36 小时内累积死亡率高达 100%。

为了应对弧菌感染，抗生素曾被广泛使用。但长期大量使用抗生素导致了诸多不良后果，不仅破坏了环境健康和生态稳定，还威胁到公共卫生和食品安全，使得耐药菌不断出现，疾病防控愈发困难。因此，寻找一种可持续且有效的替代方案迫在眉睫。

噬菌体（bacteriophage）作为一种天然的抗菌剂，能够特异性且高效地裂解细菌宿主，为解决上述问题带来了希望。近年来，研究人员陆续分离出多种弧菌噬菌体，并对其生物学和基因组特征展开研究，以评估其在水产养殖中控制弧菌病的潜力。在此背景下，本研究旨在探究两种新型裂解性噬菌体 vB_VcaP_R24D 和 vB_VcaP_R25D 用于水产养殖噬菌体治疗（phage therapy）的潜力，相关成果发表在《BMC Microbiology》杂志上。

二、研究方法

1. 噬菌体的分离与纯化：以比利时微生物协调保藏中心的坎氏弧菌 LMG 11216^T为宿主，从厦门海鲜市场的废水管道采集水样，经 0.22μm 滤膜过滤后，采用双层琼脂平板法分离噬菌体，并多次纯化。
2. 噬菌体的扩增与富集：将纯化的噬菌体加入宿主细菌培养物中，待裂解后经离心、过滤等一系列操作进行扩增和富集，最后通过 CsCl 密度梯度超速离心进一步纯化。
3. 噬菌体的鉴定与分析：运用透射电子显微镜（TEM）观察噬菌体形态；通过脂质测试判断噬菌体衣壳中是否含有脂质；绘制一步生长曲线评估噬菌体的感染、复制和裂解动力学；利用斑点试验测定噬菌体的宿主范围；提取噬菌体 DNA 进行基因组测序和分析，包括基因预测、功能注释、毒力基因和抗生素抗性基因检测等；通过 BLASTn、Clinker 和 VICTOR 等工具进行系统发育和分类学分析；在不同感染复数（MOI）下进行噬菌体裂解试验，测定其裂解活性；测试噬菌体在不同温度和 pH 条件下的稳定性。

三、研究结果

1. 噬菌体的形态特征：vB_VcaP_R24D 和 vB_VcaP_R25D 均能产生清晰的圆形噬菌斑，直径约 1mm，随时间推移逐渐扩大。TEM 分析显示，二者都属于短尾噬菌体科（Podoviridae），具有二十面体头部和短的非收缩性尾部，且尾部带有丰富的尾纤维。氯仿敏感性试验表明，它们对氯仿具有抗性，衣壳中不含脂质结构。
2. 噬菌体的生长曲线：一步生长曲线显示，两种噬菌体的潜伏期均小于 10 分钟，在释放期，vB_VcaP_R24D 的子代噬菌体粒子数（32 ± 2 PFU cell^-1）显著高于 vB_VcaP_R25D（17 ± 1 PFU cell^-1），表明 vB_VcaP_R24D 的裂解活性更强。
3. 噬菌体的宿主范围：对 57 种弧菌菌株进行宿主范围测试，结果表明 vB_VcaP_R24D 和 vB_VcaP_R25D 的裂解范围较窄，主要感染分离宿主坎氏弧菌 LMG 11216^T，表现出较强的宿主特异性，但不能排除它们感染其他未测试宿主的可能性。
4. 噬菌体的基因组特征：vB_VcaP_R24D 和 vB_VcaP_R25D 的基因组均为线性双链 DNA，长度分别为 44,258bp 和 43,376bp，G + C 含量分别为 43.69% 和 43.74%。二者均采用粘性末端位点（Cohesive End Sites）包装策略，且都不含有 tRNA、毒力因子和抗生素抗性相关基因。注释基因主要包括结构蛋白、DNA 代谢、DNA 组装、宿主裂解和辅助代谢相关基因等。
5. 噬菌体的系统发育与分类：基于 NCBI BLASTN 分析和系统发育分析，vB_VcaP_R24D、vB_VcaP_R25D 与溶藻弧菌噬菌体 VEN 具有较高的序列相似性，三者聚类在一起，属于 Autographiviridae 科中的 Trungvirus 属，但为不同物种。
6. 噬菌体的裂解活性：在不同 MOI 条件下，vB_VcaP_R24D 和 vB_VcaP_R25D 对宿主坎氏弧菌 LMG 11216^T均具有较强的裂解活性，较高的 MOI 水平裂解效果更显著。共培养 6 小时后，在所有测试的 MOI 条件下（0.001 - 10），噬菌体的杀菌效率均达到约 90%。混合两种噬菌体并未增强其整体杀菌效率。
7. 噬菌体的环境稳定性：vB_VcaP_R24D 和 vB_VcaP_R25D 在 4 - 35°C 范围内活性较高，55°C 时活性显著下降。在 pH 7 - 8 时稳定性最佳，在 pH 4 - 10 范围内仍保持较高活性，pH <3 或> 11 时完全失活。vB_VcaP_R25D 对高温和碱性条件的耐受性更强。

四、研究结论与讨论

本研究成功从厦门海鲜市场的养殖废水中分离出两种强毒噬菌体 vB_VcaP_R24D 和 vB_VcaP_R25D，它们具有诸多优良特性，如裂解活性强、潜伏期短、遗传安全性高、杀菌效果好且环境稳定性高，在水产养殖中治疗弧菌病具有较高的可行性和应用潜力。

然而，这两种噬菌体也存在一些局限性，例如宿主范围较窄。但这一特性也有其优势，能减少对养殖环境中有益微生物群落的影响。未来研究可聚焦于探索它们对更多弧菌菌株的裂解能力，开发噬菌体鸡尾酒疗法，同时研究噬菌体与益生菌联合使用的效果。此外，在实际应用前，还需考虑噬菌体的制备、储存、运输和使用过程中的环境条件等因素。

总体而言，本研究为噬菌体疗法在水产养殖中的实际应用提供了有力证据，为开发绿色可持续的水产养殖策略提供了科学指导，对推动水产养殖业的健康发展具有重要意义。