第二代生长素诱导降解系统在活体小鼠中实现蛋白质快速且可逆的降解

本文利用优化的第二代生长素诱导降解（AID）系统，在小鼠体内研究了中心体蛋白 CEP192 的功能，证实该系统适用于小鼠体内蛋白质降解研究。

　　### 研究背景
在生物学研究中，探究活体小鼠动态过程中必需基因的功能极具挑战性。传统基于 DNA 和 RNA 的基因敲除与敲低方法存在不可逆和蛋白质消耗动力学缓慢的缺陷。化学诱导降解方法，如 PROTACs（Proteolysis Targeting Chimeras）和化学遗传学方法（dTAG 系统或生长素诱导降解（AID）系统）为解决这些问题提供了新途径。然而，PROTACs 需要针对目标蛋白设计特异性化学配体，应用受限；dTAG 系统在小鼠长期应用时，因诱导蛋白降解的小分子及其载体的毒性而受限，且这两种系统都存在高浓度下的 Hook 效应。

AID 系统利用植物激素生长素作为分子胶水，在其存在时，TIR1 - SCF E3 连接酶复合物可靶向 AID 标记的蛋白质进行降解。第一代 AID 系统虽已应用于哺乳动物细胞，但存在渗漏现象且需高浓度吲哚 - 3 - 乙酸（IAA）。第二代 AID 系统（AID2）通过 Tir1 的点突变，可在低浓度的 IAA 衍生物（如 5 - 金刚烷基 - 吲哚 - 3 - 乙酸（5 - Ad - IAA）或 5 - 苯基 - 吲哚 - 3 - 乙酸（5 - Ph - IAA））作用下发挥功能。AID 系统在果蝇和秀丽隐杆线虫体内应用成功，但在小鼠体内的研究仍有待完善，尤其是在分析必需基因功能方面。

中心体蛋白 CEP192 是癌症依赖图谱（DepMap）确定的常见必需基因。中心体作为微管组织中心，在细胞分裂和纤毛形成等过程中发挥关键作用。然而，CEP192 在哺乳动物细胞中心粒复制中的作用存在争议，且其在小鼠体内的功能尚未得到充分研究。

实验设计

本研究旨在创建表达 OSTIR1 - F74G 和内源性标记 Cep192 的小鼠模型，以表征 AID2 系统在不同组织中的耐受性和有效性，并探究 CEP192 在小鼠体内的功能。研究人员通过 CRISPR - Cas9 技术构建了相关小鼠模型，并对小鼠进行 5 - Ph - IAA 处理，随后从多个方面展开实验研究。

小鼠模型构建

利用 CRISPR - Cas9 技术成功构建了 Rosa26^{LSL - OSTir1 - F74G}和 Cep192^{mAID - mNeonGreen}小鼠模型。构建 Rosa26^{LSL - OSTir1 - F74G}小鼠时，将靶向 Rosa26 位点的 sgRNA 和含有 lox - stop - lox 盒、优化密码子的 OsTir1（含 F74G 修饰）及 Myc 标签的靶向载体共注射到 B6SJL/F2 胚胎中，经与 Sox2 - Cre 雌性小鼠杂交，实现 OSTIR1 的全身表达。构建 Cep192^{mAID - mNeonGreen}小鼠时，将靶向 Cep192 最后一个外显子（48）的 sgRNA 和 DNA 供体构建体共注射，对后代进行筛选和繁殖，获得纯合子小鼠。这些小鼠模型为后续研究提供了有力工具。

5 - Ph - IAA 处理及相关分析

5 - Ph - IAA（5 - 苯基 - 1H - 吲哚 - 3 - 乙酸）在无菌 PBS 中溶解后用于小鼠腹腔注射。研究人员设置了不同的注射剂量（1mg/kg 或 5mg/kg）和注射频率（单次、每 24 小时或每 12 小时注射），对照组注射 PBS 或不处理。对小鼠进行 5 - Ph - IAA 处理后，研究人员开展了多项分析。血液和血清分析显示，重复注射有效浓度的 5 - Ph - IAA 14 天，对小鼠的血常规和血清参数无显著影响；组织病理学评估表明，该处理对小鼠多种组织未造成不良影响，这表明 5 - Ph - IAA 在小鼠体内具有良好的耐受性，为长期实验提供了可行性依据。

AID2 系统在小鼠体内的功能验证

1. AID2 系统的耐受性和长期有效性：研究发现，第一代 AID 系统使用的 IAA 在小鼠体内具有毒性，而 5 - Ph - IAA 在诱导蛋白降解的浓度下耐受性良好，且未观察到渗漏降解现象。对 Cep192^WT/WT;OsTir1^Tir/Tir小鼠连续 14 天每天注射 5 - Ph - IAA（5mg/kg），小鼠行为、体重未出现异常，组织学检查和血液分析也未发现明显变化，表明 AID2 系统适用于小鼠的长期重复给药实验。
2. AID2 系统诱导的 CEP192^AID降解动力学：给 Cep192^AID/AID;OsTir1^Tir/Tir小鼠腹腔注射 5 - Ph - IAA（5mg/kg）后，通过荧光显微镜检测不同时间点 CEP192^AID的信号强度。结果显示，30 分钟后，CEP192^AID在所有检测组织中均显著降低，小肠（SI）中降解速率最快；1.5 小时后，SI、脾脏、肺、胰腺和胃中 > 90% 的 CEP192^AID被降解；5 小时后，各组织中降解率均超 95%，SI、胰腺和胃中降解率接近 99%。给药 24 小时后，CEP192^AID信号仍保持较低水平，72 小时后，SI、脾脏和胰腺中的 CEP192^AID几乎完全恢复，其他组织恢复较慢。较低剂量（1mg/kg）的 5 - Ph - IAA 也能降解部分 CEP192^AID，但降解程度低于 5mg/kg 剂量组。这表明 AID2 系统可在不同组织中实现 CEP192^AID的快速、可逆且近乎完全的降解，且降解程度可通过 5 - Ph - IAA 剂量调节。
3. CEP192 在细胞分裂和中心体功能中的作用：为探究 CEP192 在细胞分裂和中心体功能中的作用，研究人员从胚胎中分离出原代 Cep192^AID/AID小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。用 1μM 5 - Ph - IAA 处理 MEF 细胞后，通过免疫荧光和活细胞成像发现，1 小时内中心体的 CEP192^AID几乎完全降解。5 - Ph - IAA 处理的 CEP192^AID/AID MEF 细胞在有丝分裂时几乎只形成单极纺锤体，活细胞成像显示，超过 80% 缺乏 CEP192^AID的 MEF 细胞在有丝分裂中延迟且无法分裂。用 PLK4 抑制剂 centrinone 处理或降解 CEP192^AID后对中心粒数量进行检测，结果表明，CEP192^AID降解不影响中心粒数量，反而因细胞有丝分裂失败产生多倍体细胞，导致中心粒数量增加。此外，研究人员还检测了不同处理下中心体相关蛋白的丰度，发现 CEP192^AID降解会降低有丝分裂中 CEP152 和 PLK4 的丰度，但不影响间期细胞；同时，显著降低了间期和有丝分裂中中心体 γ - 微管蛋白的丰度，这与缺乏 CEP192 的细胞中双极纺锤体形成受损的现象一致。综合来看，在小鼠中，CEP192 在中心体成熟和有丝分裂纺锤体组装中起关键作用，而非中心粒复制。
4. CEP192 在纤毛形成和维持中的作用：利用原代 MEF 细胞中 CEP192^AID的快速消耗，研究其在纤毛发生中的作用。对原代 Cep192^AID/AID MEF 细胞进行血清饥饿处理并添加 5 - Ph - IAA，结果显示，CEP192^AID降解对初级纤毛形成前和形成后的细胞数量均无影响，表明 CEP192 对初级纤毛的形成和维持并非必需。研究人员还利用小鼠气管上皮细胞（mTECs）进一步探究 CEP192 在纤毛发生中的作用。mTECs 可分化为多纤毛细胞（MCCs），在其分化过程中，CEP192^AID定位于中心体和新生成的中心粒。用 5 - Ph - IAA 处理 mTECs 后，检测发现 CEP192^AID降解对 MCCs 数量、具有运动纤毛的细胞数量以及纤毛维持均无影响。这表明 CEP192 在 MCCs 的分化、中心粒扩增、运动纤毛形成和维持过程中均非必需。
5. 长期 CEP192 缺失对小鼠的影响：对 Cep192^AID/AID;OsTir1^WT/Tir小鼠每 12 小时注射一次 5 - Ph - IAA，持续 3 天或 8 天。结果显示，3 天后，脾脏、SI 等组织中 CEP192^AID蛋白水平降低 > 95%。8 天后，Cep192^AID/AID;OsTir1^WT/Tir小鼠体重显著下降，出现胃肠道症状，SI 和结肠隐窝中大量细胞死亡，脾脏明显变小。持续的 CEP192^AID降解导致肠道隐窝有丝分裂指数增加约 2.5 倍，且大多数有丝分裂图像呈单极形态。同时，SI 中中心体 γ - 微管蛋白减少约 50%。当 CEP192^AID水平在单次注射 5 - Ph - IAA 72 小时后完全恢复时，有丝分裂指数、中心体 γ - 微管蛋白和双极纺锤体的存在均恢复正常。这表明长期使用 5 - Ph - IAA 导致体内 > 95% 的中心体 CEP192^AID降解，进而导致增殖性肠细胞有丝分裂延迟和细胞死亡。

研究讨论

本研究表明，第二代 AID 系统适用于活体小鼠中急性和长期的靶向蛋白质降解研究。与第一代 AID 系统相比，5 - Ph - IAA 耐受性良好，且无渗漏降解现象；与 dTAG 和 PROTACs 等其他体内蛋白质降解系统相比，AID2 系统使用的 5 - Ph - IAA 是小分子，可在 PBS 或生理盐水中给药，无明显毒性和炎症反应，且降解动力学快速，适用于研究有丝分裂或细胞死亡等快速过程。不过，AID2 系统对小鼠遗传学要求更复杂，需要表达 OsTir1，但条件性 OsTir1 等位基因可实现组织特异性降解，这是其他方法难以做到的。

通过 AID2 系统在原代培养和活体小鼠中的应用，研究人员发现小鼠 CEP192 对有丝分裂成功进行至关重要，而对中心粒复制、完整性和成熟无影响。CEP192 的主要功能是招募 γ - 微管蛋白进行微管成核和双极纺锤体形成，缺乏 CEP192 的细胞会形成单极纺锤体，导致有丝分裂失败并成为多倍体。在增殖性肠细胞中，CEP192 也是有丝分裂成功进行所必需的，其持续降解会导致胃肠道缺陷和脾脏缩小。此外，研究还证实 CEP192 对初级和运动纤毛的形成和维持并非必需。

本研究创建的 OsTir1 等位基因是条件性的，可通过组织特异性 Cre 活性驱动表达。在增殖较慢的组织中条件性表达 OsTir1，有望克服全身消耗 CEP192 耐受性有限的问题，为未来研究 CEP192 的细胞类型特异性功能提供可能。