软壳龟线粒体基因组研究：解开进化谜题，揭示物种奥秘

为解决软壳龟系统发育关系不明确问题，研究人员分析其线粒体基因组，明确进化特征与关系，意义重大。

　　软壳龟，这群古老而神秘的生灵，在地球的水域中已经栖息了漫长岁月。它们凭借独特的形态特征，如扁平的外壳、相对减少的骨质圆盘以及完全退化的角质表皮盾片，完美适应了水生生活。然而，在生物进化的 “族谱” 中，软壳龟的位置却一直存在争议。以往基于线粒体 DNA（mtDNA）和 / 或核标记的研究，给出的软壳龟系统发育拓扑结构并不一致，比如 Palea 属及其近缘物种的进化关系始终模糊不清。这就好比在一幅巨大的拼图中，软壳龟的那几块拼图总是放错位置，让整个进化图景变得混乱不堪。为了将这些拼图归位，还原软壳龟真实的进化历程，来自中国水产科学研究院珠江水产研究所的研究人员开展了深入研究，相关成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。在样本采集方面，分别从广西桂平的养殖场和湖南永州野外捕获了 Palea steindachneri 和 Pelodiscus axenaria 样本。之后，利用 MicroElute Genomic DNA Kit 提取基因组 DNA。对于 P. steindachneri，通过设计 11 对引物进行 PCR 扩增、克隆和测序来获取线粒体基因组序列；对于 P. axenaria，则是将基因组 DNA 送公司进行文库构建和高通量测序。在后续分析中，运用 MITOS Web Server、NCBI ORF finder 和 tRNA-scan SE等工具对线粒体基因组进行注释，借助多种软件和脚本分析碱基组成、密码子使用等特征，还通过 KaKs_Calculator 3.0 和 PAML 软件包中的 CodeML 计算蛋白编码基因的选择压力，运用贝叶斯推断（BI）和最大似然（ML）方法构建系统发育树，并使用 BEAST2 进行分歧时间估计。

研究结果如下：

• 线粒体基因组特征：P. steindachneri 和 P. axenaria 的线粒体基因组大小分别为 16,811bp 和 17,143bp。基因排列呈现典型脊椎动物特征，基因间穿插 tRNA，且无重排或重复现象。核苷酸组成偏向 A 和 T，P. steindachneri 的 A + T 含量为 61.5%，P. axenaria 为 62.7%。在 tRNA^Gly中 A + T 含量最高，分别达到 72.5% 和 72.9%。AT/GC 偏斜值显示，两条链存在不对称性，L 链更倾向于 A 和 C 的突变模式。
• 蛋白编码基因与密码子使用：两个物种共编码 3772 个氨基酸，密码子使用频率相似。富含 A + T 的密码子编码的氨基酸出现频率更高，P. steindachneri 和 P. axenaria 中富含 A + T 密码子与富含 G + C 密码子的比例分别为 1.60 和 1.56。相对同义密码子使用（RSCU）值表明，在两个软壳龟线粒体基因组的中性（或接近中性）第三位密码子位置，突变偏向于 A 和 C。
• 转运和核糖体 RNA：22 个 tRNA 基因组成符合典型脊椎动物模式，除 tRNA^Ser外均可折叠成经典的三叶草二级结构，tRNA^Ser的二氢尿嘧啶（DHU）臂缺失。两个 rRNA 基因都位于 L 链，A + T 含量高于 G + C 含量。
• 控制区：控制区位于 tRNA^Pro和 tRNA^Phe基因之间，P. steindachneri 和 P. axenaria 的控制区长度分别为 1305bp 和 1642bp，其长度差异主要源于串联重复单元数量不同。两个物种均存在多个串联重复单元，且还包含哺乳动物线粒体 DNA 中已报道的保守序列区域，但缺少 ETAS2 元件。
• 蛋白编码基因的非中性进化特征：13 个蛋白编码基因（PCGs）的 ω 值均小于 1，表明这些基因总体在纯化选择下进化。不过，atp8 基因的非同义变化数量最多且 ω 值较高，暗示其功能约束相对较弱。此外，通过位点模型比较和贝叶斯经验贝叶斯（BEB）分析发现，cytb 基因的 350 位密码子存在正选择。
• 系统发育分析：基于 5 个分区的数据集 D_PRT被证明是最佳分析方案。BI 和 ML 分析得到相同的拓扑结构，支持了 Trionychidae 和 Carettochelyidae 的单系性，Trionychidae 内存在 4 个单系分支。P. steindachneri 和 P. axenaria 都聚在 Amydona 分支（亚洲分支）内，P. axenaria 与 P. sinensis 和 P. maackii 关系密切，P. steindachneri 位于 Dogania、Nilssonia 和 Amyda 等姐妹群的基部。
• 分歧时间估计：基于贝叶斯松弛分子钟分析，软壳龟的干群起源于白垩纪，约 123.55Ma（95% HPD：96.49 - 153.77Ma），冠群年龄约为 115.84Ma（95% HPD：91.33 - 142.18Ma）。Trionychinae 亚科的分歧发生在约 75.51Ma，其最近共同祖先（MRCA）出现在第一个全球变暖期左右，之后在始新世 - 渐新世过渡时期，物种形成速率加快。

研究结论与讨论部分指出，该研究测定了 P. steindachneri 和 P. axenaria 的完整线粒体基因组，分析了其基因组特征、密码子使用、选择压力等。研究发现软壳龟线粒体基因组在核苷酸组成、控制区结构等方面有独特之处，如存在 A + T 偏向、控制区 ETAS2 元件缺失等。同时，研究明确了软壳龟的系统发育关系，解决了部分物种进化关系的争议，并且揭示了古气候变化，尤其是始新世 - 渐新世过渡时期的气候变化，可能是软壳龟物种形成的重要驱动力。此外，研究还表明，尽管软壳龟线粒体基因组不同元件的系统发育信号存在异质性，但利用完整线粒体基因组或较大部分进行分析，能够得到更可靠的系统发育拓扑结构，这为后续类似物种的系统发育研究提供了重要参考，凸显了线粒体基因组在生物进化研究中的重要价值 。