新型免疫分析技术 PICO 实现蛋白质亚型绝对定量，开启精准检测新时代

研究人员为解决免疫分析中绝对定量难题，开展 PICO 技术研究，实现蛋白质亚型精准定量，意义重大。

　　蛋白质，作为生命活动的主要承担者，在生物体内扮演着极为关键的角色。人体基因组蕴含着巨大的复杂性，由此表达出的蛋白质组更是复杂得超乎想象，其中估计有多达 100 万种蛋白质亚型（proteoforms）。这些蛋白质亚型在细胞生理活动中发挥着核心作用，它们的动态浓度变化，包括蛋白质、蛋白质相互作用（PPIs）、翻译后修饰（PTMs）等，就像细胞内部精密时钟的指针，精准调控着细胞的各种生理功能。

然而，在蛋白质研究领域，准确测定蛋白质亚型的绝对浓度一直是个棘手的难题。目前现有的蛋白质绝对定量分析方法存在诸多局限性。虽然基于质谱技术的方法在一定程度上能够进行绝对定量，但这种方法存在操作复杂、成本高昂等问题。在免疫分析领域，尽管数字免疫分析技术取得了显著进展，如单分子阵列（SIMOA）等技术能够实现超灵敏检测，但大多数数字免疫分析平台仍然依赖相对定量，缺乏真正意义上的绝对定量能力。这就好比在测量身高时，没有统一的尺子，每个人用的标准都不一样，导致测量结果无法准确比较。这种缺乏绝对定量的现状，严重阻碍了免疫分析在转化研究和临床诊断中的应用，使得不同研究之间的结果难以进行有效的比较和整合。

为了攻克这一难题，来自德国弗莱堡大学、Actome GmbH 等多个研究机构的研究人员，包括 Tobias Gross、Tobias Hundertmark、Vill? Csiszár 等，开展了一项关于蛋白质相互作用偶联（Protein Interaction Coupling，PICO）技术的研究。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为蛋白质绝对定量分析带来了新的曙光。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：
一是基于数字 PCR（dPCR）的检测技术。数字 PCR 能够对核酸进行绝对定量，研究人员将其巧妙地应用于蛋白质检测中，通过对与蛋白质结合的 DNA 标签进行 PCR 扩增，实现对蛋白质的定量分析。
二是一种独特的统计模型 ——compartment decouplexing（DX）。该模型能够根据抗体的分布差异，精准地分析数据，从而提取出关键参数，实现对蛋白质亚型的绝对定量。

下面来看看具体的研究结果：

1. 无损、零背景检测原理：PICO 技术的检测原理独具特色。在结合步骤，两个 DNA 标记的抗体（抗体对 - ABP）与目标分析物发生平衡结合；在检测步骤，基于对这些标记在反应体系中的 PCR 扩增，利用一种基于检测抗体结合分析物诱导的泊松分布偏差的新原理，实现精确的分子计数。利用 compartment decouplexing 模型对数据进行分析，能够有效过滤掉非特异性的抗体共定位信号，实现零背景检测。实验结果显示，基于 DNA 的人工偶联物的绝对检测下限低至每反应 3 个分子，这一结果充分展示了 PICO 技术在检测灵敏度和准确性方面的卓越性能。
2. 抗体亲和力独立的绝对定量理论：研究人员构建并深入分析了一种基于三元平衡的绝对定量模型（AQ 模型）。该模型呈现出非双射曲线的特征，能够为每个测量的偶联物值预测两个抗原浓度，这一特性使得其动态范围常规可达到 5 个数量级。在抗体饱和浓度条件下，PICO 检测能够实现与抗体解离常数（Kd）无关的绝对定量。通过选择合适的替代Kd值，即使在复杂浓度范围内，也能确保较高的定量精度。这意味着 PICO 技术不受抗体亲和力差异的影响，能够在不同实验条件下稳定、准确地进行定量分析。
3. 绝对定量的验证：为了验证 AQ 模型的可靠性，研究人员精心设计了一系列实验。以重组 ErbB2（his - HER2）分析物为例，在饱和条件下，采用三角 PICO（3 - cplex 检测）实验，使用三种不同的 PICO 抗体同时对分析物进行定量。实验结果令人振奋，所有测量结果在内部相互一致，并且与外部验证的重组分析物标准浓度高度吻合。同样，对重组多标签分析物（HISthioredoxin - STREP 蛋白）进行的实验也进一步证实了 AQ 模型的有效性，这充分表明 PICO 技术能够实现精准的单分子读数和准确的绝对定量。
4. PICO 在细胞基质中的验证及与外部参考的比较：研究人员进一步拓展了 PICO 技术的应用范围，将其应用于细胞基质环境中。实验选用之前在分析实验中验证过的针对 ErbB2 的三角抗体，在细胞裂解液背景下进行检测。结果显示，PICO 技术在细胞环境中能够有效避免基质效应的干扰，背景信号极低，几乎可以忽略不计。与商业 ELISA 方法相比，PICO 技术对天然 ErbB2 的绝对细胞含量测量结果在不同细胞类型中表现出高度的一致性。此外，PICO 技术的检测灵敏度远高于 Western blotting，能够检测到细胞中极低含量的蛋白质，其细胞检测限相较于 Western blotting 提高了 2000 多倍，这使得 PICO 技术在单细胞水平的蛋白质检测方面具有巨大的潜力。
5. 多重 PICO 高精度测量细胞化学计量：基于 PICO 技术可靠的绝对定量能力，研究人员设计了一种新颖的 8 重 PICO 检测方法。该方法能够同时检测多种蛋白质亚型，包括 S6K1、p4EBP1、ErbB2、ErbB3 以及它们之间的相互作用。通过对 MCF7 和 BT474 细胞在不同处理条件下的检测，研究人员发现 8 重 PICO 检测能够精确测量蛋白质和磷酸化蛋白质的水平变化，以及蛋白质复合物的化学计量关系。例如，在对 MCF7 细胞进行 dactolisib 处理后，8 重 PICO 检测准确地反映出 ErbB2、ErbB3 表达量的变化，以及 ErbB2:ErbB3 相互作用的增强；而在 BT474 细胞中，dactolisib 处理后 ErbB2:ErbB3 相互作用则显著降低，甚至低于检测限。这些结果充分展示了 PICO 技术在研究细胞内复杂信号通路和蛋白质相互作用方面的强大功能。

在研究结论和讨论部分，PICO 技术展现出了诸多优势。它突破了传统免疫分析技术的局限，实现了真正意义上的绝对定量。这种绝对定量能力对于深入理解细胞内蛋白质的功能、调控机制以及它们在疾病发生发展过程中的作用至关重要。通过精确测量蛋白质亚型的绝对浓度，研究人员能够更准确地揭示细胞内复杂的化学计量关系，为研究细胞的生理和病理过程提供了强有力的工具。

与现有的免疫分析技术相比，PICO 技术具有显著的优势。它不仅能够实现无损、零背景的检测，而且在检测灵敏度、定量准确性和多重检测能力等方面都表现出色。PICO 技术的出现，为蛋白质组学研究提供了一种全新的、可靠的分析方法，有望推动基础研究、药物研发以及临床诊断等多个领域的快速发展。然而，PICO 技术也并非完美无缺，在实际应用中可能还面临一些挑战，例如检测成本的控制、检测通量的进一步提高等。但总体而言，PICO 技术的巨大潜力为生命科学和健康医学领域的研究开辟了新的道路，为未来的精准医疗和个性化治疗提供了重要的技术支持。