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研究人员针对肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）感染问题，设计多表位疫苗并添加大肠杆菌热不稳定肠毒素（LT）佐剂，结果显示该佐剂增强免疫原性，对防治肺炎克雷伯菌感染有重要意义。
肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae），这个隐藏在医疗环境中的 “小怪兽”，可给人类健康带来了大麻烦！它是医院感染的主要病原菌之一，而且还进化出了多重耐药的 “超能力”，让现有的抗菌药物常常束手无策。据世界卫生组织（WHO）报告，全球范围内，在严重的医疗相关感染中，肺炎克雷伯菌的耐药率约达 50%。目前，虽然科学家们尝试了多种疫苗研发途径，如灭活全细胞疫苗、基于荚膜多糖的疫苗、核糖体疫苗等，但至今仍没有一款疫苗能获批，为人们提供完全的保护。
在这样的困境下，来自伊朗多所大学（Hormozgan University of Medical Sciences、Semnan University of Medical Sciences、Bushehr University of Medical Sciences）的研究人员挺身而出，开展了一项极具意义的研究。他们运用免疫信息学工具，设计出了针对肺炎克雷伯菌的多表位蛋白疫苗，并探索了添加大肠杆菌热不稳定肠毒素（LT）佐剂后的效果。该研究成果发表在《Scientific Reports》上，为肺炎克雷伯菌疫苗的研发带来了新希望。
研究人员开展这项研究时，运用了多种关键技术方法。首先，从 UniProtKB 数据库获取肺炎克雷伯菌的外膜蛋白 A（OmpA）、外膜蛋白 K17（OMPK17）和菌毛（fimbriae）的蛋白质序列。然后，借助多个生物信息学数据库和工具，如 BepiPred 2.0、Kolaskar & Tongaonkar Antigenicity、IEDB、Rankpep 等，预测 B 细胞和 T 细胞表位。接着，使用 ProtParam、VaxiJen v2.0、AllerTOP v.2 等工具对设计的蛋白质进行理化性质、抗原性、过敏原性等分析。通过 Cluspro 2.0 进行蛋白 - 蛋白分子对接，利用 GROMACS 2022 软件进行分子动力学模拟，并用 C-ImmSim 服务器模拟免疫反应。最后，运用 JCat 工具进行密码子优化，使用 SnapGene Version 3.2.1 进行克隆模拟。
下面来看看具体的研究结果：
- 表位预测与疫苗设计：研究人员利用相关数据库和工具预测了 OmpA、OMPK17 和菌毛蛋白的 B 细胞和 T 细胞表位。从这三种蛋白中筛选出 5 个富含表位的区域，将其组合并与不同连接子相连，设计出 48 种蛋白质序列。经过对这些序列的理化、抗原性、二级和三级结构等特性评估，确定了最佳疫苗候选蛋白。在此基础上，添加大肠杆菌 LT 佐剂，进一步优化疫苗设计12。
- 蛋白特性分析：对设计的疫苗候选蛋白和添加佐剂后的蛋白进行多种特性分析。ProtParam 分析显示，两种蛋白在不同温度下都稳定。VaxiJen v2.0 评估表明，疫苗候选蛋白具有高抗原性，能有效刺激免疫系统，且添加佐剂后抗原性更高。AllerTOP v.2 和 ToxinPred2 服务器检测发现，两种蛋白均无过敏原性和毒性。重组蛋白溶解度预测工具显示，它们在大肠杆菌中过表达时有潜在的溶解性34。
- 结构预测与验证：使用 GOR IV 软件预测二级结构，发现蛋白由随机卷曲、α 螺旋和 β 折叠组成。通过 I-TASSER 和 GalaxyWEB 服务器预测三级结构，并用 MolProbity、ProSA-web 和 SAVES v6.1 服务器进行验证。结果显示，两种蛋白的三级结构质量良好，Ramachandran 图分析表明模型可靠，为后续研究奠定了基础5。
- 蛋白 - 受体相互作用：通过 Cluspro 2.0 分析疫苗候选蛋白与 Toll 样受体 2（TLR2）和 Toll 样受体 4（TLR4）的结合情况。结果显示，疫苗候选蛋白与 TLR2 和 TLR4 的活性位点有强相互作用，且添加佐剂的疫苗与免疫系统受体的亲和力更高、能量更强，能与活性位点的所有氨基酸相互作用6。
- 稳定性评估：利用分子动力学模拟（MD）对设计的蛋白结构和蛋白 - 受体复合物进行 100 ns 模拟。均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）和回旋半径（Rg）等参数分析表明，添加佐剂和未添加佐剂的蛋白在模拟过程中结构稳定，且添加佐剂的蛋白与 TLR2 和 TLR4 的复合物稳定性更好7。
- 免疫反应模拟：通过 C-ImmSim 服务器模拟宿主对疫苗候选蛋白的体液和细胞免疫反应。结果显示，两种疫苗候选蛋白均能诱导可接受的免疫反应，添加佐剂的蛋白在诱导免疫球蛋白产生、B 细胞和辅助性 T 细胞（TH 细胞）增殖以及细胞因子分泌方面表现更优，这些反应对于清除肺炎克雷伯菌感染至关重要8。
- 密码子优化与克隆模拟：使用 JCat 工具对疫苗候选序列进行密码子优化，优化后密码子适应性指数（CAI）提高，GC 含量更合适。将优化后的序列克隆到 pET - 28a (+) 载体中，双酶切验证表明克隆成功9。
研究结论和讨论部分指出，该研究设计的多表位疫苗候选蛋白，尤其是添加 LT 佐剂的蛋白，在免疫信息学分析中展现出良好的应用潜力。它与 TLR2 和 TLR4 的有效相互作用，增强了免疫系统的反应，为对抗多重耐药的肺炎克雷伯菌感染提供了更有力的保障。不过，研究也存在局限性，目前的结果均基于计算机模拟，还需要进一步的体外和体内实验来验证疫苗的安全性、有效性和免疫原性。但无论如何，这项研究为肺炎克雷伯菌疫苗的研发开辟了新方向，让我们在应对这一棘手病原菌时有了新的思路和方法，有望在未来为人类健康带来实实在在的保护。
