一种用于人体骨骼肌中 CL、oxCL 和 MLCL 脂质组分析的新型 UPLC-HRMS/MS 平台

为解决 CL 等脂质分析难题，研究人员开发基于 UPLC-HRMS/MS 和 MSn的平台，该平台灵敏、可重复，已用于人体骨骼肌样本分析。

　　心磷脂（CL）是线粒体特有的磷脂，由两个磷脂酸（PA）亚基通过甘油骨架连接，带有四条酰基链。CL 影响线粒体的结构和功能，包括嵴的形态、呼吸酶活性、细胞信号传导以及细胞凋亡。CL 从头合成形成新生形式，随后通过去酰化作用进行重塑，形成单溶血心磷脂（MLCL），MLCL 再经过重新酰化形成成熟的 CL。成熟的 CL 中多不饱和脂肪酸的大量存在，使其特别容易受到细胞色素 c 介导的氧化作用，进而形成 CL 氢过氧化物。过多的 CL 过氧化会对线粒体呼吸复合物的相互位置产生负面影响，激活细胞色素 c 从线粒体内膜释放，并可能进入细胞质，引发炎症反应、细胞凋亡和细胞死亡。CL 氢过氧化物会进一步还原或脱水，生成羟基、环氧和酮类产物。长期以来，CL 代谢失调一直与线粒体功能障碍相关，并且与多种年龄相关疾病有关，如肌肉减少症、阿尔茨海默病、糖尿病、心血管疾病，以及 X 连锁遗传性巴特综合征。CL 代谢谱的改变可用作相关疾病潜在治疗方法的生物标志物。然而，由于在复杂生物样本中难以识别和量化单个分子种类的变化，尤其是低浓度的 oxCL，使得对其作用机制的研究变得复杂。因此，一种用于体内 CL 及其代谢物的全局脂质组分析方法，有助于揭示线粒体功能与健康和疾病之间的联系。

已发表的用于 CL 分析的脂质组学方法，大多基于鸟枪法和质谱成像（MSI）技术，利用高分辨率质谱仪（HRMS）且不使用色谱法，以及液相色谱 - 质谱联用（LC-MS）方法。例如，Garrett 等人通过正相（NP）色谱和 HRMS，对大肠杆菌脂质提取物中的 56 种 CL 种类进行了定量分析。在该方法中加入固相萃取后，能够检测到大鼠心脏和骨骼肌以及小鼠心脏线粒体中的低水平 MLCL。Tague 等人通过基于亲水相互作用液相色谱（HILIC）-HRMS 的靶向脂质组学研究，对粪肠球菌样本中的 23 种 CL 种类进行了定量分析。虽然这些方法能够鉴定出更多的 CL 种类，但由于脂质种类的动态范围问题，它们无法确定其他同分异构体和低丰度离子。反相（RP）LC-MS 可以解决这些局限性，能够检测更广泛的同分异构体。最近，Oemer 等人利用 RPLC-HRMS/MS 结合数学模型，在细胞培养模型和哺乳动物组织样本中鉴定出 135 种不同的 CL 质量种类以及某些低水平的 MLCL 种类。

对于单个完整 CL 种类上脂肪酰链的 sn - 位置的解析研究较少，只有少数研究描述了 sn - 位置异构体的特征。采用 MSⁿ（n = 2, 3）的鸟枪法脂质组学方法，根据单溶血磷脂酸（monolysoPA）阴离子的相对丰度来鉴定 sn - 位置异构体，包括使用单电荷去质子化的 [CL - 2H + Na]^ˉ阴离子，以及在广泛的气相质子转移离子 - 离子反应中，将双电荷阴离子 [CL - 2H]^{2 -} 转化为单电荷去质子化分子离子 [CL - H]^-。LC-ESI MS³也已用于在 sn - 位置水平上确定 27 种 CL 分子种类。其他方法包括紫外光解离（UVPD）-MS³系统，该系统可生成 CL 结构选择性碎片离子，从而确定 CL 的 sn - 位置和碳碳双键（C=C）位置。

分析极低丰度的 oxCL（通常在生物样本中占总 CL 的 < 0.5 mol%）也具有挑战性，这是由于氧以各种类型的氧官能团形式插入的复杂性，以及其在酰基链上的位置和甘油骨架上的 sn - 位置，容易导致误识别。为解决这个问题，oxCL 分析包括：一是液 - 液萃取（LLE），然后使用薄层色谱（TLC）、二维高效薄层色谱（2D-HPTLC）或固相萃取（SPE）对 oxCL 进行富集，以排除其他脂质类别进行分离；二是通过二维色谱技术（NP-LC 或 HILIC）对总脂质提取物进行分级分离，然后进行 RP-HPLC，并通过 MSⁿ、LC-MS/MS、酶水解后氧化游离脂肪酸的 LC/MS/MS，或酶水解和衍生化后氧化游离脂肪酸的 LC/MS/MS 进行分析。最近，利用 LLE 从体外模型系统中提取生成的 oxCL，并通过 RPLC-MS/MS 解析出氧化的 (18:1)₄CL 产物，通过 MS³解析出 CL 氢过氧化物。只有少数方法直接对 CL 和 oxCL 进行定量分析，包括对经历缺血 / 再灌注的大鼠肝脏中的 23 种 CL 和 oxCL 进行定量，利用 DESI MS 成像技术对人类甲状腺嗜酸细胞瘤中的 47 种（CL、oxCL 和 MLCL）进行定量，以及对人工氧化的酵母提取物中的 66 种进行定量。大多数 LC-MS/MS 方法无法在复杂生物样本中分离同分异构的 oxCL，也无法确定脂肪酰链上的氧化位点。到目前为止，据了解，还没有一种分析方法能够在一次进样中同时对生物基质中的多种 CL、oxCL 和 MLCL 进行定量分析。

在此，研究人员描述了一种基于超高效液相色谱 - 高分辨率质谱联用（UPLC-HRMS/MS）和 MSⁿ的新型平台，用于对人体骨骼肌中的 CL、oxCL 和 MLCL 进行定性和相对定量脂质组分析。该方法使用 LLE 进行总脂质提取，然后通过超高效液相色谱 - 高分辨率质谱（UPLC-HRMS）进行非靶向筛选，基于 LipidSearch 软件生成单电荷前体列表，再结合反相超高效液相色谱精确质量和高分辨率质谱联用（HRMS/MS）以及 MSⁿ，在分子种类水平以及 sn - 位置水平上，对大多数测量种类进行明确和初步的表征。对定量性能进行评估后，证明该方法灵敏且可重复。最后，所开发的方法已成功应用于人体骨骼肌活检样本分析。

材料和化学品：心磷脂标准品 (14:0)₄-CL（M₄CL）、(14:1)₄-CL、(16:1)₄-CL 和 (18:1)₄-CL 购自 Avanti，除牛心磷脂（主要含有四亚油酰心磷脂 [(18:2)₄-CL（L₄CL）]）外，纯度均 > 99%。六种氧脂标准品 (±) 9-HODE、(±) 13-HODE、(±) 9 (10)-EpOME、(±) 12 (13)-EpOME、9-oxoODE 和 13-oxoODE，纯度 > 98%，购自 Cayman Chemicals（美国密歇根州安娜堡）。四种羟基 - 环氧 - 十八碳烯酸 [9 - 羟基 - 12,13 - 环氧 - 十八碳烯酸

样品制备：开发了一种用于测定骨骼肌中 CL、oxCl 和 MLCL 的简单液 - 液萃取（LLE）方法，在不影响 L₄CL 提取的情况下优化了 oxCL 的提取。使用不存在定量水平的 CL 标准品作为参考标准，包括 (14:1)₄CL、(16:1)₄CL 和 (18:1)₄CL。十四酰基心磷脂 (14:0)₄CL（M₄CL）用作内标。测定了氯仿 - 甲醇 - 水（8:4:3，v/v/v）的萃取效率。

结论：此处描述的新方法能够分离许多同分异构体和同量异位素种类，并且实现了更高的灵敏度，尤其在氧化心磷脂脂质组学方面。这表明 UPLC-HRMS、HRMS/MS 和 MSⁿ分析，对于表征复杂组织提取物中的单个 CL、MLCL 和 oxCL 种类，以及区分不同的官能团异构体（即单氧化的 9/13-HODE-L₃CL 和 9 (10)/12 (13)-EpOME-L₃CL，以及双氧化的）是可行的。

作者贡献声明：Zhi-Xin Yuan：撰写原始草案、方法学、调查、正式分析。Josephine M. Egan：撰写 - 评审与编辑。Arsun Bektas：撰写 - 评审与编辑。Qu Tian：撰写 - 评审与编辑。Alexey Lyashkov：撰写 - 评审与编辑。Luigi Ferrucci：撰写 - 评审与编辑、项目管理。Christopher E. Ramsden：撰写 - 评审与编辑。Ruin Moaddel：撰写 - 评审与编辑、撰写原始草案。

利益冲突声明：作者声明他们没有利益冲突。

致谢：本研究完全由美国国立卫生研究院（NIH）国家老龄化研究所的内部研究项目资助。作者感谢 GESTALT 参与者和工作人员对这些研究的奉献。