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为解决 ONT 测序平台对高质量 DNA 的依赖问题，研究人员开展 RLB-MALBAC 研究，结果表明该方法可用于低量 DNA 测序，意义重大。
在基因测序的 “江湖” 中，牛津纳米孔技术（ONT）凭借着低启动成本和高灵活性，成为了众多实验室的 “宠儿”。它就像一把神奇的钥匙，似乎能打开各种核酸奥秘的大门，无论是人类还是微生物的核酸研究，都能看到它的身影。然而，这把 “钥匙” 却有个不小的 “短板”。
要想在 ONT 测序平台上顺利开展基因组测序，高质量、足量的基因组 DNA 是必不可少的 “敲门砖”。目前的测序方案主要分为两类：无扩增和基于扩增的方法。无扩增的方案虽然看似直接高效，但对输入 DNA 的质量要求极高，需要 400 ng - 1,000 ng 高质量、未降解的 DNA，这对于很多样本，尤其是单细胞基因组学、转录组学以及微生物组分析领域的样本来说，简直是个难以跨越的 “鸿沟”，因为这些样本往往起始材料有限，提取到的 DNA 不仅量少，质量也欠佳。
为了绕过这个 “障碍”，ONT 推出了基于 PCR 预扩增步骤的 SQK-RPB114.24 试剂盒，理论上它能将低至 1 - 5 ng 的输入 DNA 进行预扩增，满足测序需求。但这个试剂盒也不是 “十全十美”，它对输入 DNA 的长度有严格要求，需要长度大于 4kb 才能进行高效的标签化反应，而从临床样本或病毒基因组中获取高质量、完整且长度达标的 DNA，常常困难重重。此外，其他预扩增方法，如基于等温核酸扩增（iNAT）的多重置换扩增（MDA），虽然有一定的通用性，但也存在合成引物相关假象、偏向 GC 富集区域、对小于 2kb 的线性模板扩增效率低等问题，在微生物测序中，还容易非特异性扩增试剂中的残留 DNA，影响结果的准确性。
在这样的背景下，来自加拿大英属哥伦比亚大学（University of British Columbia）和 BC 儿童医院与妇女医院（BC Children’s and Women’s Hospital）的研究人员 Vijay J. Gadkar、David M. Goldfarb 等人，决心探索出一种更好的方法。他们开展了关于 RLB-MALBAC（一种基于多重退火和成环循环扩增技术（MALBAC）的新型非转座酶测序工作流程）的研究，相关成果发表在《BMC Methods》杂志上。
研究人员在这项研究中用到了几个关键技术方法：一是利用大肠杆菌噬菌体 λ 和临床相关细菌的纯化基因组 DNA 作为样本；二是采用 RLB-MALBAC 标记协议，在 DNA 靶标的两端附着 21 - 核苷酸长的 RLB 标签；三是通过实时 PCR 监测 RLB 标签的掺入；四是使用 SQK-RPB114.24 试剂盒对 RLB-MALBAC 文库进行条形码标记；五是借助 Flongle 进行测序，并利用一系列生物信息学工具进行数据分析，包括将原始 POD5 文件转换为 FASTQ 格式、修剪条形码、质量检查、序列比对、组装和注释等。
研究结果主要从以下几个方面展开：
- RLB-MALBAC 系统的概念工作机制：RLB-MALBAC 系统巧妙地结合了两个关键过程，即随机在目标基因组中掺入 21 碱基长的 RLB 标签序列，以及通过独特的环形成机制富集两端含有 RLB 标签的 DNA 序列。经过多轮循环，最终产生线性 DNA 和两端带有 RLB 标签的环形扩增子，这些环形扩增子可被 PCR 指数扩增，用于后续测序1。
- RLB-MALBAC 在模型 DNA 模板上的应用：以大肠杆菌噬菌体 λ DNA 为模型，研究人员用不同浓度的模板进行 RLB-MALBAC 实验。实时 PCR 结果显示，不同浓度的模板都能产生强烈的扩增信号，且信号强度呈剂量依赖性，最低可检测到 0.025 ng 的模板。纳米孔测序结果表明，即使使用低至 5 ng 的输入 DNA，也能获得较高的基因组覆盖率和良好的测序数据，证明了该方法在低量 DNA 测序中的可行性23。
- RLB-MALBAC 对细菌模板的测序：对多种细菌基因组 DNA 进行 RLB-MALBAC 扩增后，实时 PCR 检测到所有模板都有强烈的扩增信号，表明 RLB 标签成功掺入细菌基因组。对标准 ATCC 分离株和临床分离株进行纳米孔测序分析，结果显示能获得不同数量的高质量 reads，覆盖细菌基因组。同时，通过综合抗生素耐药性数据库（CARD）预测 β - 内酰胺酶基因，发现对于 ATCC 菌株，预测结果与参考序列 100% 一致；对于临床菌株，虽然大部分预测结果与抗生素敏感性测试相符，但也存在部分差异，如 K. pneumoniae 的 CARBA 01 分离株中未检测到 NDM 类 β - 内酰胺酶基因45。
在研究结论和讨论部分，RLB-MALBAC 方法展现出诸多优势。它能够从微量的目标 DNA 中获得高质量的基因组数据，且由于 MALBAC 系统的准线性扩增特性，可最大程度地保留目标 DNA 的代表性，减少偏差。该方法的通用性很强，在病毒、质粒、真核细胞研究，尤其是单细胞基因组学领域具有广阔的应用前景。然而，该方法也存在一些局限性，例如依赖 PCR 导致生成的 DNA 文库片段大小在 1 - 4 kb 之间，可能影响纳米孔测序的长读长优势；此外，研究未对提取 DNA 的分子量进行评估，且未测试该方法对大基因组或极度有限的 DNA 样本（如单细胞基因组学中的样本）的适用性。
总的来说，RLB-MALBAC 方法为低量基因组 DNA 的测序提供了一种创新且有效的解决方案，虽然存在一些不足，但依然为生命科学和医学研究领域开辟了新的道路，有望在未来的研究中不断完善，发挥更大的作用。
