重大发现！载脂蛋白 E—— 生长板静止区软骨细胞的全新标志物

为寻找静止区软骨细胞（RCs）标志物，研究人员经单细胞 RNA 测序等研究，发现载脂蛋白 E（ApoE）是新标志物，意义重大。

　　在骨骼的生长发育过程中，生长板（growth plate）起着至关重要的作用。它就像一个神奇的 “工厂”，源源不断地制造出新的软骨细胞，推动着骨头的纵向生长。生长板中的静止区（resting zone，RZ）更是这个 “工厂” 的核心调控区域，它不仅储存着具有干细胞特性的细胞，还能像交通指挥员一样，调节软骨细胞的更新和增殖，对骨骼的正常生长发育意义非凡。

然而，目前科学家们在研究生长板静止区时遇到了不少难题。其中最棘手的就是缺乏一个能全面、精准标识静止区软骨细胞（resting chondrocytes，RCs）的标志物。以往研究虽发现了一些能标记静止区干细胞的基因，比如 Pthlh、Axin2 和 Foxa2 等，但这些基因都只能部分标记静止区软骨细胞，无法涵盖所有细胞。这就好比用一把有漏洞的筛子去筛选物品，总会有一些被遗漏。所以，研究人员只能依据一些不太精确的组织学标准来界定静止区，比如根据细胞的形状来判断，但这种方法主观性强，不同研究人员的判断结果可能差异很大，严重影响了对静止区的深入研究。

为了解开这些谜团，来自美国马里兰大学医学院（University of Maryland School of Medicine）等机构的研究人员展开了一项极具意义的研究。最终，他们成功发现载脂蛋白 E（apolipoprotein E，ApoE）是小鼠和人类生长板静止区软骨细胞的一种全新的、特异性的标志物。这一发现就像在黑暗中点亮了一盏明灯，为深入研究生长板静止区的细胞生物学机制和骨骼生长发育过程提供了关键线索。该研究成果发表在《Bone Research》杂志上。

研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。首先是单细胞 RNA 测序（single-cell RNA sequencing，scRNAseq），它能在单细胞水平上对细胞的基因表达进行全面分析，就像给每个细胞做了一次详细的 “基因体检”。其次是荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH），它可以在组织切片上精准定位特定基因的表达位置，让研究人员直观地看到基因在细胞中的分布情况。此外，研究人员还构建了 Apoe^mCherry敲入小鼠模型，通过观察 mCherry 的表达来追踪 Apoe 阳性细胞的变化。

下面来看具体的研究结果：

1. scRNAseq 分析和 FISH 验证精准识别生长板软骨细胞群：研究人员从 4 周龄处于生长高峰期的雌性 C57BL/6J 小鼠的股骨和胫骨中分离出软骨细胞，利用 scRNAseq 技术进行分析。通过无监督数据分析，得到了 11 个不同的细胞簇。随后，研究人员利用 FISH 技术对这些细胞簇进行验证，依据一些已知的细胞特异性标记基因的表达情况，成功注释出 5 个生长板软骨细胞簇、关节软骨细胞簇、软骨膜细胞簇等多种细胞类型。
2. Apoe 在生长板 RCs 中普遍且特异性表达：研究人员进一步对生长板软骨细胞进行分析，筛选出含有生长板软骨细胞的簇并重新聚类。经过一系列分析，在 41 个符合条件的差异表达基因中，Apoe 脱颖而出，它在 RCs 簇中的表达细胞比例超过 97%，且与其他簇相比，其表达的差异倍数高达 3.87 。FISH 实验证实，Apoe 可以准确区分生长板的静止区。免疫荧光染色还发现，APOE 在人类生长板静止区的软骨细胞中也有高表达，这表明 Apoe 在不同物种的生长板静止区软骨细胞中可能具有保守性。
3. Apoe^mCherry标记二级骨化中心形成后的 RCs：为了更深入地研究 Apoe 表达的 RCs，研究人员构建了 Apoe^mCherry报告小鼠模型。经过一系列检测发现，该模型不会导致小鼠出现异常的全身或骨骼表型。在小鼠出生后的骨骼发育过程中，mCherry 的表达在二级骨化中心（secondary ossification center，SOC）形成前未在胫骨骨骺软骨中检测到，SOC 形成后，mCherry 阳性软骨细胞开始出现在胫骨静止区。随着小鼠年龄增长，生长板中 mCherry 阳性 RCs 的比例在 9 周龄时达到峰值，之后逐渐下降。
4. mCherry⁺ RCs 是慢周期软骨细胞：通过 EdU 脉冲追踪实验，研究人员发现与增殖性柱状软骨细胞相比，mCherry⁺ RCs 进入细胞周期的比例更低，且失去 EdU 标记的速度更慢，这表明 mCherry⁺ RCs 是慢周期细胞。同时，研究还发现 mCherry⁺ RCs 由异质性细胞群体组成，包括处于休眠状态的干细胞和激活的祖细胞。
5. mCherry⁺ RCs 具有异质性，包含具有高增殖潜力和多能性的骨骼祖细胞：研究人员通过对 mCherry⁺ RCs 进行分析，发现其中约一半具有多能细胞的特征，部分细胞具有自我更新的小鼠骨骼干细胞（skeletal stem cells，SSC）、前骨 - 软骨 - 基质祖细胞（pre-bone, cartilage and stromal progenitors，pre-BCSP）和骨 - 软骨 - 基质祖细胞（bone, cartilage and stromal progenitors，BCSP）的特征。此外，体外实验表明，分选的 mCherry⁺ RCs 能够分化为成骨细胞和软骨细胞，且具有较高的增殖潜力。

综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。Apoe 作为生长板静止区软骨细胞的全新标志物，为研究人员提供了一个强大的工具，有助于更深入地了解静止区软骨细胞的生物学特性和功能。Apoe^mCherry小鼠模型的建立，也为研究人员在体内研究静止区软骨细胞的动态变化和功能提供了便利。这一研究成果不仅有助于揭示骨骼生长发育的机制，还可能为治疗骨骼相关疾病，如生长发育迟缓、骨质疏松等，提供新的思路和潜在靶点。不过，目前 APOE 在生长板静止区软骨细胞中的具体生物学功能还不完全清楚，仍有待进一步研究。相信随着研究的不断深入，这一领域将会取得更多重要突破，为人类的骨骼健康带来新的希望。