利用非侵入性视觉报告基因优化毛喉鞘蕊花遗传转化体系，推动药用植物研究新进展

为解决毛喉鞘蕊花（Coleus forskohlii）研究中遗传转化及监测难题，研究人员优化 A. rhizogenes 介导的基因转化体系，成果有助于代谢工程研究。

　　

一、研究背景

在大自然的 “药房” 里，植物一直是人类获取有益化合物的宝库。从食品工业中作为调味剂、色素和饲料添加剂，到制药领域成为重要的生物活性成分来源，植物的价值不言而喻。据统计，全球约 35% 的药物源自天然产物，其中植物贡献了 25% ，是当之无愧的 “主角”。

毛喉鞘蕊花，这种来自印度的神奇药用植物，更是备受瞩目。它是福斯高林（forskolin）唯一的天然来源。福斯高林是一种具有重要工业和治疗应用价值的生物活性萜类化合物，它就像一把神奇的 “钥匙”，能激活腺苷酸环化酶，提升细胞内 cAMP 水平，在对抗肥胖、心血管疾病、哮喘和青光眼等病症方面发挥着关键作用。正因如此，福斯高林在医药、保健品和化妆品市场都大受欢迎，市场前景十分广阔。

然而，毛喉鞘蕊花的种植和生产面临着诸多挑战。其产量不稳定，难以满足全球日益增长的需求。为了突破这些困境，科研人员将目光投向了生物技术，其中发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的基因转化技术，成为了培育毛状根（HRs）的有力工具。但传统的报告基因，如绿色荧光蛋白（GFP）、β - 葡萄糖醛酸酶（GUS）等，在使用过程中存在各种问题，比如需要特殊设备、化学底物，或是检测过程具有侵入性，不利于高效监测转化情况。因此，开发一种更高效、便捷的遗传转化和监测体系迫在眉睫。

在此背景下，来自印度 Osmania 大学和 Kakatiya 大学的研究人员展开了深入研究，旨在建立一套优化的遗传转化系统，推动毛喉鞘蕊花的研究和应用。他们的研究成果发表在了《Discover Plants》杂志上。

二、研究方法

研究人员采用了一系列关键技术开展研究。首先，以 12 周龄的毛喉鞘蕊花离体再生叶片和节段作为外植体（从植物上切取下来用于组织培养的部分）。通过将携带 RUBY 报告基因和潮霉素磷酸转移酶基因（hptII，用于筛选转化细胞）的质粒，利用冻融法导入发根农杆菌 A4 和 ATCC 15834 菌株中。随后，对影响转化效率的多个因素进行优化实验，包括潮霉素浓度、预培养时间、细菌细胞密度、感染时间、共培养时间和乙酰丁香酮浓度等。最后，利用 CTAB 法提取疑似转基因毛状根和野生型根的基因组 DNA，通过 PCR 分析来确认转基因的整合情况。

三、研究结果

1. 潮霉素敏感性测定：研究人员将叶片和节段外植体接种在添加不同浓度潮霉素的培养基上，结果发现，当潮霉素浓度达到 3.0mg/L 时，外植体在培养 3 周后开始褐变，叶片外植体甚至完全变白，进一步提高浓度会显著降低外植体的存活率。这表明 3.0mg/L 的潮霉素可作为后续筛选转化体的适宜浓度。
2. 预培养时间的影响：预培养时间对外植体的转化效率有着显著影响。研究发现，预培养 2 天可使转化效率达到最高。以 A4 菌株感染的节段外植体为例，预培养 2 天的转化效率高达 58.75%，叶片外植体感染 A4 菌株的转化效率也达到了 52.67%。有趣的是，即使不进行预培养，外植体也能表现出一定的转化效率。
3. 细菌细胞密度的影响：优化细菌细胞密度对提高转化效率至关重要。实验结果显示，随着细菌细胞密度（OD₆₀₀）的增加，转化效率显著提高，在 OD₆₀₀为 0.6 时达到峰值。但超过这个阈值，转化效率会明显下降。
4. 细菌感染时间的影响：感染时间同样影响着转化效率。研究表明，随着感染时间延长至 20min，转化效率显著增加，继续延长感染时间则会导致效率降低，且在共培养时会出现细菌过度生长的现象。如 A4 菌株感染节段外植体 20min 时，转化效率可达 58.75 ± 0.14% 。
5. 共培养时间的影响：共培养时间在转化过程中起着关键作用。在黑暗中共培养 24 - 72h 的实验中，A4 菌株感染的节段外植体共培养 60h 时，转化效率最高。
6. 乙酰丁香酮浓度的影响：乙酰丁香酮作为一种酚类化合物，可通过激活农杆菌中的 vir 基因来提高转化效率。研究人员测试了不同浓度的乙酰丁香酮，发现 100μM 的浓度在两种外植体和两种菌株中均能实现最高的转化效率。
7. 细菌菌株的影响：对比 A4 和 ATCC 15834 两种菌株，A4 菌株在诱导毛状根方面表现更为出色。以节段外植体为例，A4 菌株感染后的转化频率最高可达 58.75%，而 ATCC 15834 菌株感染的节段和叶片外植体转化效率相对较低。
8. 转基因毛状根的分子确认：通过 PCR 扩增，研究人员对红色的疑似转基因根进行检测，结果显示，所有转化根的 DNA 样本均扩增出了 hptII 基因特有的 314bp 产物，而野生型根则未出现该条带，这证实了 hptII 基因已成功整合到植物基因组中。

四、研究结论与意义

本研究成功建立了一套高效且可重复的毛喉鞘蕊花转基因毛状根诱导体系，利用发根农杆菌 A4 和 ATCC 15834 菌株，结合非侵入性的 RUBY 报告基因作为视觉标记。在优化条件下，A4 菌株感染的节段外植体转化效率最高，达到 58.75 ± 0.14%。PCR 分析进一步证实了 hptII 基因的整合，RUBY 标记系统能够直观区分转基因（粉色）和非转基因（白色）毛状根。

这一研究成果意义重大，为毛喉鞘蕊花的代谢工程研究提供了坚实的平台。通过该体系，研究人员可以更方便地引入新的候选基因或进行基因组编辑，有望进一步提高福斯高林的产量，或是探索毛喉鞘蕊花中其他潜在的药用成分。此外，该研究结果也为其他植物的毛状根培养系统提供了宝贵的参考，推动了整个植物生物技术领域的发展，让人们在利用植物资源开发新药和其他生物产品的道路上迈出了重要一步。