高效建立杜梨叶片再生及遗传转化体系，助力梨树分子育种

为解决杜梨（Pyrus betulifolia）遗传转化体系缺乏的问题，研究人员建立其再生体系并获得转基因植株，推动分子育种。

　　梨，作为全球重要的果树之一，在中国水果产业中占据着举足轻重的地位，其产量位居国内水果第三位。在梨树的栽培过程中，嫁接是一种常用的无性繁殖方式，而杜梨凭借其出色的抗寒、抗旱特性以及强大的嫁接亲和力，成为北方地区广泛应用的优良砧木。

随着科技的飞速发展，基因工程技术为植物品种改良带来了新的曙光。相较于传统育种方法，它能够精准地对植物进行定向改造，大大缩短育种周期，在培育具有更强抗逆性和更优果实品质的新品种方面展现出巨大潜力。然而，在梨树的研究领域，尽管转基因技术已经取得了一定进展，但仍面临诸多挑战。

目前，大多数梨品种，尤其是一些东方梨品种和砧木，缺乏稳定且高效的遗传转化体系。这一现状严重制约了梨树分子育种的步伐，使得科研人员难以深入探究砧木对植株矮化和果实品质的影响机制，也无法充分利用转基因技术将优质外源基因导入杜梨，从而调控接穗的优良性状。

为了突破这些瓶颈，中国农业大学的研究人员勇挑重担，开展了一项极具意义的研究。他们致力于筛选具有高再生能力的杜梨基因型，建立高效稳定的叶片再生体系，并在此基础上实现杜梨的遗传转化，为梨树的分子育种和功能研究奠定坚实基础。相关研究成果发表在《Horticulture Advances》杂志上。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过精心筛选杜梨种子，培育出大量盆栽苗和组培苗，从形态学特征和再生率等多方面进行评估筛选。接着，对不同基因型杜梨叶片的再生参数进行全面优化，包括培养基成分、激素浓度、暗培养时间等。此外，利用农杆菌介导法将携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的载体导入杜梨叶片，通过 PCR 技术检测转基因植株，确保实验结果的准确性和可靠性。

研究结果主要包含以下几个方面：

1. 筛选高再生潜力基因型：研究人员从 3000 株盆栽苗和 4000 株组培苗中，精心挑选出 100 株生长态势良好的植株进行深入分析。经过严格筛选，确定了 DL-7、DL-88、DL-90、DL-100 和 TDL39 这 5 种再生率超过 50% 的基因型。其中，TDL39 表现最为突出，其再生效率最高，增殖系数达到 4.7，因此被选定用于后续的再生培养基优化和遗传转化实验。
2. 优化再生和生根培养基：研究人员以 MS 和 NN₆₉为基础培养基，添加不同浓度的 6 - 苄氨基腺嘌呤（6 - BA）、噻二唑苯基脲（TDZ）、萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）等生长调节剂进行对比实验。结果表明，添加 3mg/L TDZ 和 0.1mg/L IBA 的 NN₆₉培养基对杜梨叶片不定芽诱导效果最佳，再生率可达 56.1%。此外，TDL39 基因型的不定芽在生根培养基上经过 7 天暗培养和 30 天光照培养后，生根成功率高达 90%，且所有生根苗移栽至温室后全部存活。
3. 探究影响叶片再生的因素：研究发现，暗培养时间对杜梨叶片再生有显著影响。随着暗培养时间的延长，不定芽再生率逐渐升高，在 28 天达到峰值 59.3%，之后再生效率有所下降。同时，叶片处理方式和放置方向也会影响再生效果，切碎叶片并将其背面朝上接种在培养基上，能显著提高再生率，最高可达 72.8%。另外，60 天龄的 TDL39 叶片再生能力最强，再生率高达 81.5%。
4. 确定遗传转化条件及获得转基因植株：研究人员通过设置不同浓度的卡那霉素（Kan）筛选培养基，确定了杜梨叶片抗再生的临界浓度为 20mg/L。在此基础上，利用携带 GFP 基因的 pBI121 载体进行遗传转化实验，经过 5 个月的筛选和培养，成功获得了转基因植株。经 PCR 检测和绿色荧光观察，最终确定转化效率为 4.2%。

在研究结论和讨论部分，研究人员成功建立了杜梨叶片不定芽再生的最优培养基，即 NN₆₉基础培养基添加 3.0mg/L TDZ、0.10mg/L IBA、30g/L 蔗糖和 6.6g/L 琼脂，实现了 100% 的再生率。同时，成功构建了杜梨的遗传转化体系，在 15mg/L Kan 筛选条件下获得了过表达 GFP 的转基因植株。

这项研究成果意义非凡，不仅筛选出了高再生率的杜梨基因型，为后续遗传转化提供了理想材料，还建立了高效稳定的叶片再生和遗传转化体系，为深入研究梨树基因功能、调控砧木与接穗关系以及培育梨树新品种开辟了新途径，有力地推动了梨树分子育种技术的发展，为梨树产业的可持续发展注入了新的活力。