甘蓝型油菜 AHAS 突变体 K4 抗除草剂遗传特性研究：为油菜育种开辟新路径

为解决油菜田除草难题，研究人员对 AHAS 突变体 K4 展开研究，发现其抗性由单基因控制，有重要育种价值。

　　在农业生产的大舞台上，油菜作为全球重要的油料作物，尤其是在中国，其种植面积广泛，为人们提供了丰富的食用油。然而，随着油菜机械化生产的快速发展，杂草问题逐渐成为制约油菜产量和质量的 “拦路虎”。在油菜田里，杂草与油菜争夺阳光、水分和养分，严重影响油菜的生长发育。传统的除草方式不仅耗费大量人力物力，效果还不尽如人意。因此，培育抗除草剂的油菜品种，搭配相应的除草剂配方，成为了最经济有效的除草策略。

在此背景下，西北农林科技大学的研究人员 Yani Zhang、Qianxin Huang、Shengnan Wang 等对甘蓝型油菜（Brassica napus L.）AHAS 突变体 K4 展开了深入研究，相关成果发表在《Stress Biology》上。这一研究对于丰富油菜抗除草剂遗传资源、推动油菜育种进程具有重要意义。

研究人员为了探究 K4 的奥秘，运用了多种关键技术方法。在遗传分析方面，通过将 K4 与不同油菜品系杂交获得 F₁、F₂和 BC₁代，对这些后代进行除草剂处理和表型观察，以此研究抗性遗传规律；在基因分析上，采用 PCR 扩增和测序技术，对 K4 和野生型的 BnAHAS 基因进行分析，找出突变位点；利用表面等离子共振（SPR）技术，检测除草剂与 BnAHAS3 蛋白的亲和力；构建含 BnAHAS3^535T的表达载体转化拟南芥，验证该基因的功能 。

下面来看看具体的研究结果：

• 突变体 K4 对不同除草剂的交叉抗性：研究人员在 K4 和野生型 ZS9 的五叶期，用不同浓度的四种除草剂（TBM、BSM、MES 和 FU）进行叶面喷施。结果发现，ZS9 对这四种除草剂几乎都很敏感，而 K4 对 TBM、BSM 和 MES 表现出一定程度的抗性，但对 FU 敏感。进一步研究表明，K4 对 TBM、BSM 和 MES 的抗性分别约为 ZS9 的 50 倍、30 倍和 5 倍。
• AHAS 酶活性测定：为了探究 K4 抗除草剂的原因，研究人员检测了 K4 和 ZS9 幼苗在不同除草剂处理后的 AHAS 酶活性。结果显示，K4 和 ZS9 幼苗的 AHAS 酶活性在未处理时没有显著差异，说明 K4 的抗除草剂特性不是由 AHAS 活性增加引起的。但在喷施 TBM、BSM 和 MES 后，K4 的 AHAS 酶活性随除草剂浓度增加下降缓慢，其 I₅₀值远高于 ZS9，表明 K4 抗除草剂是由于 AHAS 功能获得性突变，而非过表达。
• 突变体 K4 的 TBM 抗性遗传分析：研究人员将 K4 与 ZS9、SH11 杂交，对 F₁、F₂和 BC₁代幼苗进行 4.5 g a.i. ha^-1 TBM 叶面喷施处理。结果表明，所有 F₁个体都表现出一定的 TBM 抗性，说明抗性由显性基因控制。F₂和 BC₁代群体的分离比符合孟德尔遗传定律，证明 K4 的除草剂抗性由一对核基因控制，且具有显性抗性。
• 突变体 K4 与野生型 BnAHAS_1-3的比较测序：研究人员扩增了 K4 和 ZS9 的 BnAHAS1、BnAHAS2 和 BnAHAS3 基因并测序。结果发现，K4 的 BnAHAS1 和 BnAHAS2 与 ZS9 无差异，但 BnAHAS3 编码区第 535 位发生单核苷酸多态性（SNP），由 C 变为 T（BnAHAS3^535T），导致 BnAHAS3 第 179 位的脯氨酸（Pro）被丝氨酸（Ser）取代（BnAHAS3^P179S），这一突变可能是 K4 抗除草剂的原因。
• BnAHAS3 蛋白的结构分析：通过对 BnAHAS3 蛋白进行疏水聚类分析、亲水性分析、二级结构和三维结构预测，研究人员发现 K4 中 BnAHAS3^P179S的疏水簇分布和亲水性发生变化，其与 TBM 的结合能降低，结合位点改变，无法形成稳定的平面堆叠效应，使得 K4 对 TBM 表现出耐受性。
• TBM 与 BnAHAS3 的亲和力检测：利用 SPR 技术检测 TBM 与 BnAHAS3 的亲和力，结果表明，ZS9 中 BnAHAS3 与 TBM 的结合速率常数 k_a、结合量更高，解离速率常数 k_d更低，亲和力常数 K_D也更低，说明 ZS9 中 BnAHAS3 与 TBM 的亲和力高于 K4 中 BnAHAS3^P179S与 TBM 的亲和力。
• BnAHAS3^535T在拟南芥中的异位表达赋予植株除草剂抗性：将含有 BnAHAS3^535T的表达载体转化到野生型拟南芥中，以 BnAHAS3^535C为对照。结果显示，喷施 1.0 mg?L^-1 TBM 和 BSM 后，转 BnAHAS3^535T的拟南芥幼苗几乎无症状，喷施 1.0 mg?L^-1 MES 后仅有轻微损伤，而野生型和转 BnAHAS3^535C的幼苗均死亡，表明 BnAHAS3^535T赋予 K4 抗除草剂能力。
• 等位基因特异性（AS）标记的开发和共分离分析：研究人员基于 BnAHAS3 序列设计了 AS-PCR 引物，开发出 CAPS3 标记。该标记可有效区分含有 BnAHAS3^535T抗性等位基因的纯合和杂合个体，且与 K4 和 ZS9 杂交的 F₂群体中的除草剂抗性共分离，可用于未来油菜抗除草剂育种。

综合研究结果和讨论，甘蓝型油菜突变体 K4 对 TBM、BSM 和 MES 三种除草剂具有一定抗性，其抗性由一个显性核基因控制。经过 AHAS 酶活性测定、AHAS 蛋白结构分析、SPR 分析以及拟南芥转基因实验证实，BnAHAS3^535T赋予了 K4 抗除草剂的能力。这一研究成果为油菜抗除草剂育种提供了新的种质资源，K4 中的抗除草剂基因可与其他抗性材料的基因叠加，培育出抗性更强的品种。同时，开发的 AS-PCR 标记有助于在油菜育种中高效筛选抗除草剂材料，推动油菜抗除草剂育种进程，对解决油菜田除草难题、提高油菜产量和质量具有重要意义。