利用微粒轰击高粱幼胚的无转基因基因组编辑加速系统

为解决植物基因组编辑中外源 DNA 的问题，研究人员开发无转基因高粱编辑系统，可在 T0代实现编辑，推动商业化。

　　

研究背景：植物基因组编辑的困境与突破需求

在植物研究领域，CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列及其相关核酸酶 9）系统就像一把神奇的 “基因剪刀”，广泛应用于植物基因功能研究、分子育种以及作物改良等方面。它能精准地对植物基因组进行编辑，让科学家们可以按照意愿改造植物基因，培育出更优良的品种。

然而，这把 “剪刀” 在使用过程中却带来了一些麻烦。通常，CRISPR/Cas9 系统中的 Cas9 核酸酶和引导 RNA（gRNA）需要通过构建载体，稳定整合到植物基因组中才能发挥作用。但这些外源 DNA 在完成基因编辑任务后，依旧留在植物基因组里。这不仅可能引发脱靶效应，持续对基因组进行不必要的编辑，还会在植物商业化进程中遭遇重重阻碍。因为全球多数监管系统将含有外源 DNA 的植物归类为转基因生物（GMOs），这类植物在市场准入等方面面临严格的监管限制。

为了突破这一困境，来自澳大利亚昆士兰大学的研究人员 Yan Zhang、Ming Cheng、Karen Massel、Ian D. Godwin 和 Guoquan Liu 开展了一项极具意义的研究，致力于开发一种无转基因的基因组编辑系统，相关成果发表在《aBIOTECH》杂志上。

研究方法：关键技术助力突破

研究人员在这项研究中运用了多种关键技术。首先是微粒轰击技术，将构建好的质粒载体导入高粱幼胚组织。他们构建了两个重要的质粒，pBUN411-zCas9 质粒携带玉米密码子优化的 Cas9 基因（zCas9），由玉米泛素启动子（Ubi）驱动；SbPDS_gRNA 质粒包含两个靶向高粱八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因的 gRNA，同时还带有新霉素磷酸转移酶（NPTII）基因，赋予植物对遗传霉素（G418）的抗性。之后，通过 PCR 筛选和 Sanger 测序对编辑事件进行鉴定和分析，还利用 RT-PCR 检测 Cas9 基因的表达情况 。

研究结果：高效编辑与无转基因植株的获得

1. 加速筛选潜在基因组编辑高粱：研究人员选择 PDS 基因作为靶基因，因为 PDS 基因编码类胡萝卜素生物合成中的关键酶，对叶绿素起到光保护作用，其突变会导致植物白化，便于直观观察基因编辑效果。构建好质粒后，通过微粒轰击法将两个质粒共转化到高粱自交系 Tx430 的幼胚组织中。转化后的组织被分为两组，分别在含抗生素（30mg/L 遗传霉素）的选择性再生培养基（SRM）和不含抗生素的再生培养基（RM）上进行培养。实验结果令人惊喜，在 RM 组中，白化高粱植株的再生效率（每幼胚）为 11.1 - 14.3%，而 SRM 组仅为 4.2 - 8.7%。从幼胚启动到评估白化植株，整个过程仅需约 80 天（11.4 周），与传统高粱转化系统相比，大大缩短了时间。
2. 白化植株的基因分型分析：对 RM 组和 SRM 组的白化植株进行 PCR 筛选，结果显示不同植株的 PDS 基因扩增片段大小不同，这表明发生了多种基因组编辑活动，如大片段缺失、潜在的双等位基因编辑等。进一步分析发现，由于使用了双 gRNA 系统，大片段缺失是最常见的编辑事件，占比 58.8%，其次是复杂重排（26.5%）和小片段插入缺失（5.9%）。通过针对质粒不同区域设计的 6 对引物进行 PCR 检测，判断植株的转基因状态。结果发现，RM 组中部分白化植株未检测到 NPTII 基因的 PCR 条带，而 SRM 组中多数白化植株含有 NPTII 基因，但也有个别植株（如 SPDSM - 5 和 SPDSM - 10）因早期脱离筛选未检测到该基因。最终，在 RM 组的实验 1 和实验 2 中，分别鉴定出 4 株和 8 株无转基因的基因组编辑植株。
3. CRISPR/Cas9 编辑事件的验证：Sanger 测序结果证实，在 RM 组和 SRM 组的白化植株中，CRISPR/Cas9 成功对 PDS 基因进行了编辑，编辑结果主要包括小片段插入缺失、大片段缺失、复杂重排以及无变化四种类型。其中，大片段缺失和复杂重排是主要的编辑事件，这再次印证了双 gRNA 系统的作用。
4. Cas9 基因表达分析：通过 RT-PCR 对部分具有不同 DNA 整合模式的白化植株进行 Cas9 基因表达分析，结果显示只有同时含有 Cas9 基因和 Ubi 启动子的植株（如 SPDSM - 3 和 PDSM - 17）才能检测到 Cas9 基因的表达，这表明 Cas9 基因及其启动子（Ubi）对于 Cas9 在细胞中的表达至关重要。
5. 重复实验结果比较：实验 2 在实验 1 的基础上进行了优化，增加了 RM 组的培养板数量，并缩短了 SRM 组的筛选时间。实验 2 的结果与实验 1 一致，RM 组再生植株数量和无转基因白化植株数量均有所增加，无转基因基因组编辑植株的频率在实验 1 中为 22.2%，在实验 2 中提高到 38.1%。SRM 组通过优化筛选程序，白化植株的产生频率从实验 1 的 4.2% 提高到实验 2 的 8.7%，且获得了 2 株无转基因的白化植株，频率为 5.9%。

研究结论与意义：开启作物育种新篇章

这项研究成功开发出一种利用微粒轰击高粱幼胚的无转基因基因组编辑加速系统，在 T₀代就能够高效获得无转基因的基因组编辑高粱植株。在非筛选（RM）组的两个独立实验中，分别有 22.2% 和 38.1% 的纯合 / 双等位基因编辑株系被鉴定为无转基因株系，这一成果具有重要意义。它极大地加快了无转基因编辑植株的培育进程，节省了传统方法中通过自交或杂交去除转基因元件所需的大量时间和精力。

此外，该方法为无性繁殖作物（如菠萝、甘蔗和香蕉等）的无转基因基因组编辑提供了新途径，有望推动这些作物的商业化进程。尽管研究还存在一些可优化的地方，如进一步改进 CRISPR/Cas9 系统的设计、探索更好的筛选标记等，但这项研究无疑为植物基因组编辑领域开辟了新的方向，为培育更优良、更安全的作物品种奠定了坚实基础，让我们在利用基因编辑技术服务农业生产的道路上迈出了重要一步。