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本文开发了可注射的 GelMA 水凝胶，负载靶向 miR-222 的工程化细胞外囊泡，有效减轻心肌 IRI，极具研究价值。
引言
心血管疾病（CVDs）是全球主要致死原因。尽管现有治疗手段能使部分患者缓解，但再住院和死亡率仍居高不下。急性心肌梗死（MI）、心力衰竭（HF）等心脏疾病严重威胁人类生命，成为重大公共卫生问题。再生心脏疗法有望为严重心肌缺血再灌注损伤（IRI）和 HF 提供精准治疗。机械水凝胶基无细胞贴片可在力传感机械转导下抑制心肌缺血梗死区域，减轻心肌壁应力，预防左心室功能障碍重塑。不过，生物功能水凝胶虽应用广泛，但可注射水凝胶通过力传感机械保护治疗 CVDs 的潜力仍有待挖掘。
冠状动脉缺血缺氧会导致心肌细胞死亡，进而引发 MI。临床治疗手段虽能恢复冠状动脉缺血灌注，但灌注后会因压力过载和高活性氧物种对心肌细胞造成二次损伤。IRI 与心肌细胞微环境和细胞外基质（ECM）组装密切相关，尤其是 ECM 重塑。心肌细胞与 ECM 微环境相互作用时，会产生整合素黏附偶联受体，改变纳米机械相互作用并将机械信号传递到细胞核，这对维持心肌细胞代谢和存活至关重要。此外，心肌细胞几何拓扑结构的改变会影响心脏重塑，而心肌 IRI 会破坏细胞骨架力学的动态平衡。
细胞外囊泡（EVs）由间充质干细胞（MSCs）分泌，直径约 100nm，含有多种生物分子，可用于心脏修复。此前研究表明，血小板膜融合的循环 EVs 可增强靶向摄取能力，抑制细胞凋亡，改善心脏功能。MSC 来源的 EVs 也可通过无注射喷雾法负载到水凝胶中用于治疗心脏疾病。研究还发现，miR-222 可促进心肌细胞生长和增殖，保护心脏免受病理重塑。因此，探究 miR-222 过表达的 EV 负载心脏贴片在 IRI 重塑中的作用机制意义重大。本研究合成了可注射的明胶甲基丙烯酰（GelMA，GEL）水凝胶，构建了靶向 miR-222 的工程化 EV（TeEVs），并将其负载到水凝胶中形成可注射的 TeEV 负载心包水凝胶贴片，通过微创注射到心包腔，旨在缓解心肌 IRI。
结果
TeEV 负载水凝胶贴片的制备与可行性
通过光敏固化构建了负载 TeEVs 的可注射心包 GEL 水凝胶贴片，用于心肌 IRI 的微创治疗。合成 GEL 水凝胶时，通过改变甲基丙烯酸酐（MAA）浓度控制其机械性能。1H-NMR 分析和傅里叶变换红外光谱证实了 GEL 前体的成功合成，扫描电子显微镜（SEM）显示其具有均匀多孔结构，流变学测量表明其凝胶稳定性良好。
从人脐带 MSCs 中分离出 EVs，经电穿孔使其过表达 miR-222，再用心脏缺血靶向多肽修饰得到 TeEVs。透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示，TeEVs 呈纳米球形，粒径约 80 - 130nm。将 TeEVs 负载到 GEL 水凝胶后，原子力显微镜（AFM）测量发现其杨氏模量与 GEL 水凝胶相近，且黏附力增强。TeEVs 在 GEL 水凝胶中的释放呈先快后慢的趋势，6h 内约释放 40%，72h 累计释放 70%。此外，水凝胶的吸收能力和降解性不受 TeEVs 影响，细胞活力实验表明水凝胶具有良好的生物相容性。
GEL-TeEVs 增强细胞内化并拯救 OGDR 应激的 NRCMs 细胞凋亡
研究发现，CSTSMLKAC 心脏缺血靶向肽（CTP）可增强 EVs 的细胞内化能力。通过荧光标记实验、流式细胞术检测发现，TeEVs 在正常和氧糖剥夺再灌注（OGDR）应激的新生大鼠心肌细胞（NRCMs）中均表现出较高的摄取水平。Tunel 染色和蛋白质免疫印迹（WB）分析表明，TeEVs 和 GEL-TeEVs 可显著减少 OGDR 应激的 NRCMs 中 Tunel 阳性细胞数量，降低 Bax/Bcl2 和 cleaved caspase-3/caspase-3 比值，具有强大的抗凋亡作用。此外，qPCR 和 WB 分析显示，TeEVs 和 GEL-TeEVs 可下调下游靶基因 Hmbox1 和 HIPK2 的表达水平，而 HIPK1 表达不受影响。
体内 TeEVs 的心肌靶向递送与保留
心脏位于胸腔深处，心脏水凝胶贴片是一种有前景的治疗方法。本研究设计了可注射的 TeEV 负载心包水凝胶贴片，通过微创注射到心包腔，形成心脏水凝胶贴片。体内成像实验表明，CTP 靶向的工程化 EVs（TeEVs 和 GEL-TeEVs）在心肌组织中的荧光强度明显高于非靶向组，且可在心肌组织中积累并长期保留。生物相容性水凝胶可在体内固化形成心脏保护贴片，负载的 TeEVs 可缓慢释放，用于慢性心脏病的长期修复。
GEL-TeEV 贴片缓解急性心肌 IRI
构建心肌 IRI 模型，在缺血 30min 后，心包注射 GEL-TeEV 形成水凝胶贴片，再灌注 24h。2,3,5 - 三苯基氯化四氮唑（TTC）染色结果显示，GEL-TeEV 组梗死面积与危险面积比值显著降低，表明其可有效减小梗死面积。Tunel 染色和 WB 分析表明，GEL-TeEV 治疗可显著抑制心肌细胞凋亡，降低乳酸脱氢酶（LDH）水平，减轻心肌损伤。此外，GEL-TeEV 还可下调炎症因子 IL-1β、TNF-α 和 IL-6 的表达水平，下调 Hmbox1 和 HIPK2 表达，且对主要器官无明显毒性。
GEL-TeEV 贴片改善心脏 IRI 重塑中的心脏功能障碍
构建缺血 30min 再灌注 3 周的 IRI 模型，经 GEL-TeEV 注射治疗。超声心动图检测发现，GEL-TeEV 组左心室射血分数和缩短分数显著改善，表明心脏功能得到提升。Masson 染色和 WB 分析显示，GEL-TeEV 组心脏纤维化程度明显减轻，纤维化相关蛋白 α - 平滑肌肌动蛋白（α - SMA）、Ⅰ 型胶原蛋白 α1 链（Col1a1）和 Ⅲ 型胶原蛋白 α1 链（Col3a1）表达降低。此外，GEL-TeEV 还可抑制病理心脏基因 ANP、BNP 和 β - MHC 的表达，减轻心肌细胞肥大，抑制心脏纤维化和病理重塑。
GEL-TeEV 贴片激活心脏细胞内机械转导
力传感生物物理刺激对调节心肌细胞形态发生和细胞骨架分布至关重要。在 3 周 IRI 小鼠模型中，分析整合素表达发现，GEL-TeEV 贴片可增强整合素 - 黏附偶联受体（IACRs）在脂筏微结构域的积累。WB 分析显示，GEL-TeEV 贴片可恢复 vinculin 组装，促进细胞内细胞骨架组织。荧光成像发现，talin - 1 表达在 GEL-TeEV 处理后增强，表明 GEL-TeEV 贴片可促进细胞内细胞骨架形成。
myosin 荧光成像显示，GEL-TeEV 处理后其强度增加，为 TeEV 内化提供驱动力。IRI 重塑时，Piezo1 表达增强，而 GEL-TeEV 贴片可缓解这种过载力学。AFM 测量发现，GEL-TeEV 处理可降低心脏组织杨氏模量，增强黏附力。此外，GEL-TeEV 贴片可通过调节 Yes 相关蛋白（YAP），增强力传感机械转导，改善核 laminA/C 结构完整性，促进有效 IRI 修复。在急性 IRI 小鼠中，GEL-TeEV 贴片同样可促进 YAP 机械转导，增加核 laminA/C 表达，改善心脏功能。
GEL-TeEV 贴片增强 NRCMs 纳米力学的潜在机制
为探究 GEL-TeEV 贴片通过细胞骨架重塑和核机械转导拯救 IRI 的潜在机制，研究在 NRCMs 中进行了相关实验。vinculin 染色显示，GEL-TeEV 处理可增强细胞黏着斑（FA）形成。myosin 染色表明，细胞骨架结构在 GEL-TeEV 处理后组织良好。机械阳离子通道 Piezo1 在细胞培养板硬化时过表达，而 GEL-TeEV 可抑制其过量表达。AFM 测量发现，GEL-TeEV 处理可使细胞变硬，降低黏附力。YAP 结果显示，GEL-TeEV 处理可使 YAP 信号富集在细胞质中，减少其核转位。综合来看，GEL-TeEV 贴片可通过调节细胞纳米力学，激活力相关信号通路，促进 TeEV 治疗剂的摄取，改善 IRI 和心脏重塑。
讨论
心血管组织工程通过促进心脏修复来减轻心肌损伤，水凝胶贴片是其中的有效工具。目前心脏贴片植入多采用开胸手术，创伤大，而微创注射技术虽有应用，但依赖形状记忆生物材料可能破坏心包。原位可注射水凝胶贴片为心脏再生和修复提供了新途径。
心脏 IRI 会加剧病理肥大和心脏纤维化，最终导致 HF。机械转导在心脏疾病中起关键作用，为保护心脏机械转导免受 IRI 影响，本研究开发了可注射 GEL 水凝胶，并结合 miR-222 工程化 EVs，有效缓解了心脏功能障碍。与干细胞治疗相比，EVs 或无干细胞来源的外泌体避免了伦理和免疫排斥问题，且能改善 IRI 治疗效果。
力传感机械转导是心血管系统 IRI 修复的潜在机制。心肌细胞通过整合素与 ECM 相互作用，形成 FA，介导细胞形态变化，增强 EVs 内化。此外，机械力还可刺激瞬时受体电位香草酸亚型 4 和 Piezo1 阳离子通道，影响钙离子内流，调节转录因子和细胞骨架重组。机械力还可抑制经典 Hippo 通路，促进 YAP 核质转位，调节基因表达。机械转导还可通过 laminA/C 和 LINC 复合物从细胞骨架传递到核包膜，影响核形态、染色质组织和基因调控。
在 GEL-TeEV 水凝胶贴片保护下，TeEVs 可快速从水凝胶中释放并被心肌细胞摄取，减少心肌细胞凋亡和心脏纤维化。本研究表明，靶向工程化 TeEVs 从机械水凝胶贴片中释放，可通过调节机械信号激活、黏附相关蛋白组装、细胞骨架力通道开放和核机械转导，改善急性心肌 IRI 和心脏重塑。
研究局限性
GEL-TeEV 心脏贴片存在一定局限性。本研究仅在体外评估了其对受损细胞的拯救能力，在体内实验中仅使用了雄性 C57BL/6 小鼠模型，未对非人灵长类动物进行研究。由于机械水凝胶模型的可降解性，未研究 TeEVs 超过 3 周的长期保留效果。此外，TeEVs 可能对非心肌细胞如成纤维细胞和内皮细胞产生潜在脱靶效应。
资源可用性
如需进一步信息、资源和试剂，可联系通讯作者 Prof. Junjie Xiao（junjiexiao@shu.edu.cn）。本研究所有试剂可在签订材料转移协议后从通讯作者处获取。研究数据可在合理请求下由通讯作者共享，除 1H-NMR 外未报告原始代码，1H-NMR 原始数据已存入 Protein DataBank，登录号分别为 Gelatin BMRB ID: 26354 和 GelMA BMRB ID: 26355。
