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本文介绍 FISH-scRACS-seq 技术，通过多实验验证其性能，揭示环烷烃降解机制，助力微生物群研究。
一、研究背景
微生物群落凭借丰富多样的代谢活动，支撑着地球上众多关键的生态过程，像元素的地球化学循环、环境修复以及宿主的营养利用等。为深入剖析其运作机制并挖掘潜在生物资源，通常采用两种策略。
“基因型” 驱动策略以微生物群全基因组关联研究（MWASs）为代表，它通过将宏基因组与生态系统特征关联，识别基于 DNA 序列的分类或功能基因标记 。MWAS 能高通量地发现与生态系统特征相关的生物或基因，却难以验证标记分类群的原位功能，也无法追溯功能对应的基因组、途径或酶，尤其对于未培养的标记生物。
“代谢表型” 驱动策略的典型是拉曼激活细胞分选和测序（RACS-seq），这一方法能直接识别与生态系统特征对应的目标代谢单细胞，并追踪代谢活动至单细胞基因组 。但目前 RACS-seq 通量较低，导致采样深度浅、研究范围窄，难以针对性探究目标细胞的原位代谢，其产生的单细胞代谢表型和基因组是否具有生态相关性也不明确。
为应对这些挑战，研究团队引入了一种系统发育 - 代谢双导向的单细胞组学方法 —— 荧光原位杂交引导的单细胞拉曼激活分选测序（FISH-scRACS-seq），该方法在解析和挖掘微生物群功能方面具有重要意义。
二、FISH-scRACS-seq 技术概述
FISH-scRACS-seq 的工作流程包含三个关键步骤。第一步是荧光原位杂交（FISH），利用针对目标分类群设计的催化报告沉积荧光原位杂交（CARD）-FISH 探针，直接在微生物群样本中定位目标分类群的单个细胞 。由于 FISH 过程可能损害细胞活力，所以在杂交前需进行预处理，如添加稳定同位素标记底物（如 D2O、H13CO3?、15N2），以便后续基于单细胞拉曼光谱（SCRS）分析代谢表型。
第二步是单细胞拉曼激活细胞分选（scRACS）。经过 FISH 处理的细胞，会基于目标系统发育（通过 FISH 探针）和目标代谢表型（通过 SCRS）进行区分和分选。在 RAGE 芯片中，利用 532-nm 激光对悬浮的 CARD-FISH 标记细胞逐个进行 SCRS 分析，获得高信噪比的光谱 。随后，通过单细胞 RAGE 耦合测序（scRAGE-seq）技术，使用 1,064-nm 激光捕获那些 SCRS 图谱与目标代谢表型匹配的 CARD-FISH 标记细胞，形成单细胞包裹液滴并依次输出。
第三步是测序（seq）。包裹在液滴中的 FISH-RACS 处理后的细胞，会以单细胞单管的方式进行细胞裂解、多重置换扩增（MDA）和基因组测序 。由于单细胞液滴已含有矿物油相，加入裂解缓冲液后，只需涡旋试管就能形成用于 MDA 的乳液反应（即 MDA 反应在油包水乳液的微小水滴内进行） 。经过质量评估后，对单细胞 MDA 产物进行鸟枪法测序，再进行从头组装和计算机模拟基因组分析，从而在单细胞分辨率下，将目标代谢活动直接追溯到基因组序列。
三、FISH-scRACS-seq 技术的验证
研究人员从多个方面对 FISH-scRACS-seq 技术进行了验证。首先，利用纯培养的大肠杆菌（E. coli）K-12 DH5α 进行实验。给细胞提供 50% D2O 模拟代谢分析，此时拉曼光谱在 2,157 cm?1处出现峰值，表明存在 C-D 拉伸振动 。用针对 γ- 变形菌纲的 GAM42a 探针进行 CARD-FISH 标记后，通过 scRAGE-seq 基于分类群特异性荧光信号和 C-D 带对细胞进行分选 。从 20 个分选细胞中，12 个成功进行了 MDA 和 PCR 反应，每个细胞产生了约 1 Gb 的原始测序数据 。这些 FISH-scRACS-seq 衍生的单细胞基因组（SAG）组装完整性在 65.74% - 95.53% 之间，60% 的 SAG 完整性超过 80%，证明该技术能产生高质量 SCRS 和高覆盖度的单细胞基因组 。
研究人员还比较了 RAGE 和拉曼激活细胞弹射（RACE-seq）两种技术对 FISH-scRACS-seq 的适用性。结果显示，FISH-scRACS-seq 在所有组装指标（基因组完整性、测序偏差和组装连续性）上均优于 RACE-seq，能恢复更多基因 ，因此后续实验选择 RAGE 用于 FISH-scRACS-seq 。此外，通过将 FISH-scRACS-seq 获得的 SAG 与 scRAGE-seq 获得的 SAG 进行比较，发现尽管 FISH 可能对基因组质量有一定影响，但 FISH-scRACS-seq 仍能为大肠杆菌产生功能明确、高覆盖度的单细胞基因组。
为评估 FISH-scRACS-seq 在微生物群中的性能，研究人员构建了一个包含枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）H6、大肠杆菌 K-12 DH5α、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）D11 和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4742 的四物种模拟菌群 。用 GAM42a CARD-FISH 探针进行杂交，显微镜检查显示该探针能特异性标记大肠杆菌细胞，且 FISH 标记前后大肠杆菌细胞的比例无显著差异，证明了 CARD-FISH 的高灵敏度和特异性 。对模拟菌群进行分选实验，结果表明，通过 16S PCR 产物的 Sanger 测序，所有 MDA 阳性细胞均为大肠杆菌特异性 16S rDNA 序列，SAG 的基因组完整性在 19.12% - 99.76% 之间，平均映射率为 35.21% - 47.53%，成功率在 40% - 70% 之间 ，空液滴作为阴性对照未检测到阳性结果，进一步支持了 FISH-scRACS-seq 的高特异性和高灵敏度。
土壤微生物群具有高度的代谢和基因异质性，研究人员以此为实际环境样本评估 FISH-scRACS-seq 的性能 。采集浅层土壤样本，对其中代谢活跃但丰度较低、可作为土壤污染响应 / 指示物的 γ- 变形菌纲进行 CARD-FISH 标记 。从土壤样本中分离出 10 个携带荧光 CARD-FISH 信号（目标分类群）和 C-D 峰（目标代谢活力）的单个细胞，进行 FISH-scRACS-seq 测序 。经过质量控制和从头组装，获得了 5 个 SAG，其中 4 个 SAG 恢复了 23S rRNA 基因片段，且与 GAM42A 探针的杂交位点完全匹配，分类注释表明这些 SAG 均来自 γ- 变形菌纲 。FISH-scRACS-seq 衍生的 SAG 与 scRAGE-seq 和 SAG-gel 衍生的 γ- 变形菌纲 SAG 相比，在连续性和完整性上无显著差异 ，这表明在分析复杂微生物群落时，将 FISH 纳入 scRACS-seq 不一定会降低 SAG 的质量。此外，通过 FISH-scRACS-seq 还在土壤微生物中发现了携带编码 A 类 β- 内酰胺酶基因的质粒，凸显了该技术在复杂自然微生物群研究中的重要性。
四、FISH-scRACS-seq 技术在污染海水研究中的应用
环烷烃广泛存在于地下烃类储层和凝析气中，对水生生物毒性大且难以降解，大规模漏油时会带来重大生态风险 。尽管对海洋生态系统中环烷烃的生物降解机制了解甚少，但 MWAS 研究发现，中国边缘海域中一组未培养的嗜冷、贫营养 γ- 变形菌纲与环烷烃降解有关 。研究人员对来自渤海某大型凝析气田的海水样本进行研究，通过全基因组测序（WGS）分析了 7 个不同稀释比的海水样本的宏基因组，组装并分箱得到 7 个 γ- 变形菌纲的宏基因组组装基因组（MAGs），这些 MAGs 属于 P. fuliginea，但均未编码环烷烃降解途径 。
为探究 γ- 变形菌纲与环烷烃降解之间的机制联系，研究人员开发了 MWAS 耦合 FISH-scRACS-seq 工作流程 。用 γ- 变形菌纲靶向 CARD-FISH 探针快速识别与环烷烃降解相关的单个细胞，基于细胞的 D2O 摄入率（以 SCRS 中的 C-D 带表示）分析其原位环烷烃降解活性 。对系统发育 - 代谢双靶向细胞进行分选并在单细胞分辨率下测序，挖掘负责该功能的途径和基因 。海水样本在添加环己烷（唯一碳源和能源）和 50% D2O（追踪微生物代谢活力）的条件下于 10°C 孵育，16S rRNA 扩增子测序表明 γ- 变形菌纲与环己烷利用相关 。当溶解氧（DO）水平因微生物烃呼吸降至 0 μM 时，对海洋微生物群进行 FISH 处理 。通过 SCRS 分析，筛选出具有 C-D 带（表明环烷烃降解活性）的细胞，经 FISH-scRACS-seq 处理后，对 3 个单细胞 MDA 产物进行进一步测序 。这 3 个单细胞基因组（m1、m4 和 m7）均被归类为 P. fuliginea，与参考基因组的平均核苷酸同一性（ANI）大于 97% 。与 MAGs 相比，FISH-scRACS-seq 衍生的 SAGs 能更完整准确地重建单个环己烷降解细胞的基因组，还发现了许多 MAGs 中未恢复的基因、细胞特异性突变和更多的插入序列 。
基于 m1、m4 和 m7 的 SAGs，对碳水化合物活性酶（CAZymes）进行注释，发现 m1 中存在 91 个 CAZyme 基因，表明其具有利用多种碳水化合物的能力 。计算 m1 和 m7 之间 2,748 个单拷贝直系同源基因的 dN/dS 值，发现受最强正选择的基因中 CAZymes 显著富集，暗示这些生物在适应不同碳源时面临着强大的生态压力。
五、新发现的细胞色素 P450PsFu的功能及生态意义
目前尚不清楚 Pseudoalteromonas spp. 是否能降解环己烷，但 m1、m4 和 m7 细胞在以环烷烃为唯一碳源时表现出较强的代谢活力 。研究人员聚焦于完整性最高的 m1 基因组（94.35%），在其中发现了一个由 yjiB（编码细胞色素 P450 蛋白 P450PsFu）、camA（putidaredoxin 还原酶）和 fdxE（铁氧还蛋白）组成的三组分细胞色素 P450 系统 。P450PsFu与已知能将环己烷转化为环己醇的 CYP450cha 相似度仅 25.8%，属于 CYP236A 亚家族，该亚家族通常以 6-O - 甲基 - D - 半乳糖（G6Me）为底物 。但考虑到 P450 酶底物特异性的多样性，研究人员推测 P450PsFu可能氧化环己烷 。分子对接分析显示，环己烷与 P450PsFu通过氢键和强静电相互作用结合，亲和力高于 CYP450cha 。
为验证这一假设，研究人员进行了体外酶活性测定 。优化 P450PsFu及其天然氧化还原伙伴 camA 和 fdxE 的序列，使其符合大肠杆菌密码子偏好性，表达并纯化得到均一的蛋白 。用来自聚球藻（Synechococcus elongatus）PCC 7942 的 SelFdR0978 和 SelFdx1499 作为替代氧化还原伙伴蛋白，重建 P450PsFu的体外活性 。通过气相色谱 - 质谱（GC-MS）分析，发现反应产物中存在与纯环己醇保留时间和离子碎片相同的化合物，证明 P450PsFu在 SelFdR0978 和 SelFdx1499 的支持下，能够将环己烷转化为环己醇，这是环己烷降解的第一步和限速步骤 。这一发现揭示了 CYP236A P450 亚家族酶在氧化环己烷方面的新功能和生态多功能性。
CYP236A P450 亚家族酶主要存在于拟杆菌门和 γ- 变形菌纲中 。在 47 个已测序的 Pseudoalteromonas spp. 基因组中，只有 4 个包含该亚家族成员，这些基因位于染色体上，属于 “辅助” 基因，可能通过水平基因转移或独立进化产生 。其中两个物种（P. fuliginea PS2 和 P. mariniglutinosa NCIMB 1770）最初从海洋藻类表面分离，暗示 P450 介导的细菌利用藻类多糖的共生关系 。此外，在北极海的 P. arctica A 37-1-2 中也发现了类似基因，表明 CYP236A P450 亚家族酶介导的环己烷降解可能具有全球生态意义 。通过对多个数据库的搜索发现，CYP236A P450 基因数量稀少，主要分布在低温海洋生态系统中，这与海洋环己烷汇的分布一致，表明它们可能在全球低温海洋中环己烷降解中发挥重要作用，为石油泄漏时生物强化去除烃类污染物提供了潜在途径。
六、研究展望
FISH-scRACS-seq 技术为微生物群功能研究带来了新的突破，但仍有进一步发展的空间。在探针方面，虽然 CARD-FISH 探针提高了目标细胞的检测能力，但未来可通过多重探针杂交，同时探究多种标记生物的表型 - 基因组 - 基因联系 。此外，FISH 探针不仅可针对分类标记，还能基于核苷酸序列靶向功能基因，从而拓展该技术在突变文库、微生物群、甚至动植物组织中研究目标基因体内功能的应用。
在技术通量方面，尽管目前已能从多种生态系统中获取高质量 SCRS 和高覆盖度单细胞基因组，但 FISH-scRACS-seq 的分选通量（3 - 8 细胞 /min）有待提高 。可通过改进 RAGE 芯片设计、结合基于人工智能的图像分析和自动化技术，或采用高通量的流式 RACS 系统，实现对复杂微生物群更深入的采样，分析更多样化的细胞功能。
在细胞培养方面，FISH-scRACS 操作后对目标细胞进行培养十分必要。已有研究表明，细胞在 RACS 后仍可保持活力，如在废水解磷细菌的 scRACS 培养和小鼠结肠微生物群黏蛋白降解微生物的 pool-based RACS 培养中 。未来应探索活细胞 FISH 技术结合 RACS-seq，避免化学交联或固定对细胞活力的损害。
综上所述，微生物群功能的机制解析滞后于 MWASs 发现生态系统特征相关标记生物（和标记基因）的速度 。FISH-scRACS-seq 技术能够高效揭示酶、途径、基因组以及原位代谢功能，针对 MWAS 发现的具有生态相关性的细胞进行研究，无论其是否可培养 。因此，MWAS-FISH-scRACS-seq 有望成为系统全面解析和挖掘地球上众多生态系统中微生物群功能的有效策略，为微生物学研究和生态环境保护等领域开辟新的道路。
