探索 M1 巨噬细胞与羊膜上皮细胞 EMT 关联：揭秘胎膜早破新机制

为探究细胞外囊泡（EV）是否触发羊膜上皮细胞（AECs）的上皮 - 间质转化（EMT），研究发现 M1 巨噬细胞的 EV - miR - 146a/155 可诱导 AECs 发生 EMT，增加胎膜早破（PROMs）风险，为 PROMs 治疗提供新方向。

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在孕育新生命的奇妙过程中，胎膜就如同守护胎儿的 “安全堡垒”，它的完整性至关重要。然而，胎膜早破（PROMs）这一孕期并发症却时常威胁着母婴健康，不仅可能引发早产，导致新生儿发育不良、感染等一系列问题，还会给产妇带来心理和生理上的双重负担。尽管科学家们一直致力于揭开胎膜早破的神秘面纱，但其中的发病机制仍有许多未知之处。

已有研究发现，羊膜上皮细胞（AECs）发生的上皮 - 间质转化（EMT）在胎膜早破过程中扮演着重要角色。EMT 是一个复杂的生物学过程，简单来说，就是原本具有极性的上皮细胞会逐渐失去其上皮特性，获得间质细胞的表型。这一转变在肿瘤细胞的增殖和转移中起着关键作用，同时也参与了多种哺乳动物组织的器官发生。在胎膜中，AECs 的上皮表型对于维持胎膜的强度和稳定妊娠至关重要。但令人困惑的是，究竟是什么因素触发了 AECs 的 EMT，进而导致胎膜早破，目前还没有明确答案。

此外，细胞外囊泡（EVs）作为细胞间通讯的重要媒介，近年来受到了广泛关注。EVs 是纳米级的囊泡，直径在 50 - 200nm 之间，呈 “碟” 状，由各种细胞分泌，含有细胞蛋白、脂质、DNA 和 RNA 等物质。在羊水中，EVs 也被发现存在，并且已有研究表明其与胎膜早破的发病机制相关。然而，羊水中源自 M1 巨噬细胞的 EVs 与 AECs 之间的调控相互作用，却鲜为人知。

为了攻克这些难题，来自济宁医学院、浙江农林大学以及中国农业科学院等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》上，为我们理解胎膜早破的发病机制带来了新的曙光。

研究人员采用了多种关键技术方法来开展这项研究。首先，构建了脂多糖（LPS）诱导的小鼠胎膜早破模型，同时设置了自然分娩（NL）和剖宫产（CS）的对照组，用于对比分析。其次，通过免疫荧光、蛋白质免疫印迹（western blot）、实时荧光定量聚合酶链式反应（real - time PCR）等技术，检测相关蛋白和基因的表达水平。此外，还运用了纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）对 EVs 进行表征，并利用原子力显微镜（AFM）来评估羊膜的生物力学性能。在样本队列来源方面，使用了 100 只特定病原体 - free 级的成熟近交系怀孕昆明小鼠，同时收集了来自济宁医学院附属医院妇产科的人类羊膜和羊水样本。

下面让我们详细了解一下研究结果：

1. AECs 中的 EMT 和招募的巨噬细胞：研究人员对比了 LPS 诱导的 PROMs、自然分娩（NL）和剖宫产（CS）三组小鼠。免疫荧光和 western blot 分析显示，在阴道分娩（包括 LPS 诱导的 PROMs 和 NL）的小鼠羊膜中，间质标记物（N - cadherin）显著增加，而上皮标记物（E - cadherin）减少，剖宫产组则呈现相反趋势。同时，利用抗 F4/80 抗体分析发现，LPS 处理后，子宫和羊水中 F4/80 阳性细胞（巨噬细胞）数量明显增多。这表明在 LPS 诱导的胎膜早破模型中，AECs 发生了 EMT，并且巨噬细胞被招募到子宫和羊水中。
2. 不同模型羊水中 EVs 的 miRNA 特征：从 CS 和 LPS 处理的 PROM 模型羊水中分离出 EVs，经 TEM、NanoSight 和 western blot 分析，这些 EVs 呈圆形，直径在 50 - 200nm 之间，具有 EVs 的典型标记物。进一步分析其 miRNA 谱，发现 64 种 miRNA 存在显著变化。将其中排名前十的 miRNA 转染到 AECs 中，结果显示 miR - 146a - 5p 和 miR - 155 - 5p 异位表达后，E - cadherin 水平显著降低。实时 PCR 证实，LPS 处理后，EV - miR - 146a 和 EV - miR - 155 上调，且携带这些 miRNA 的 EVs 能够有效转移到 AECs 中。这说明 LPS 处理后的羊水中，EVs 的 miRNA 特征发生改变，其中 miR - 146a 和 miR - 155 可能在 AECs 的 EMT 过程中发挥重要作用。
3. EV - miRNAs 对 AECs 的影响：在 LPS 处理的怀孕小鼠的原生 AECs 中，miR - 146a 和 miR - 155 水平显著升高。对过表达这两种 miRNA 的 AECs 进行 RNA 测序和基因集富集分析（GSEA），发现上皮 - 间质转化途径发生显著变化。通过分析预测的靶基因，确定了 miR - 146a 和 miR - 155 的多个靶基因，如 Numb 和 Ehf 等，这些基因参与调节 β - catenin 通路和上皮表型相关分子。双荧光素酶报告系统分析证实了 miR - 146a 与 Numb 的 3’UTR 相互作用，miR - 155 与 Ehf 相互作用。此外，研究还发现 MMP - 9 在 LPS 处理和 NL 模型中的阳性率显著高于 CS 模型，且 MMP - 9 表达与 β - catenin 激活呈正相关。这一系列实验表明，EV - miR - 146a 和 EV - miR - 155 是 AECs 发生 EMT 的关键触发因素，并且与 MMP - 9 的表达和 β - catenin 通路的激活密切相关。
4. M1 极化巨噬细胞的 EVs 对 AECs 的作用：研究人员推测 M1 极化巨噬细胞（M1 巨噬细胞）的 EVs 在诱导 AECs 发生 EMT 中起重要作用。他们从怀孕小鼠羊水中分离出巨噬细胞，经 LPS 和 INF - γ 刺激使其极化为 M1 巨噬细胞，然后提取 EVs。实验发现，LPS 和 INF - γ 促进了 EVs 的生物发生和释放，且 M1 巨噬细胞来源的 EVs（M1 - EVs）中 miR - 146a 和 miR - 155 上调。用 M1 - EVs 处理 AECs 后，E - cadherin 表达显著降低，β - catenin 激活并转移到细胞核，Ehf 在细胞核中的荧光强度下降。这表明 M1 - EVs 能够促进 AECs 发生 EMT。
5. RNA 结合蛋白介导 miRNA 包装进入 EVs：基于 EVs 中 miR - 146a 和 miR - 155 的水平，研究人员假设巨噬细胞将这些 miRNA 与特定的 RNA 结合蛋白（RBP）一起包装到多泡体（MVB）中，然后释放到细胞外。通过数据库分析发现，多聚嘧啶束结合蛋白 1（PTBP1）与 miR - 146a 特异性结合，非 POU 结构域包含八聚体结合蛋白（NONO）与 miR - 155 特异性结合。一系列实验，如使用特异性 siRNA 抑制 PTBP1 和 NONO 的表达、免疫荧光分析、荧光共定位分析以及 miRNA 下拉实验等，证实了 PTBP1 和 NONO 参与调节 EV - miR - 146a 和 EV - miR - 155 的水平，并且在巨噬细胞极化后，这些 RNA 结合蛋白与 miRNA 的相互作用增强，促进了 miRNA 从 M1 巨噬细胞通过 EVs 转移到 AECs。
6. 不同处理对 AECs 的影响及体内验证：研究人员将 miR - 146a/155 或 si - Numb/Ehf 加载到源自 M0 巨噬细胞的 EVs 中，并干扰 M1 巨噬细胞中 PTBP1 和 NONO 的表达，得到不同处理的 EVs。将这些 EVs 与 AECs 孵育后发现，M1 - EVs 和加载了 miR - 146a/155 或 si - Numb/Ehf 的 M0 - EVs 能够有效促进 AECs 发生 EMT 并激活 Wnt/β - catenin 通路，而 M0 - EVs 和干扰 PTBP1/NONO 表达后的 M1 - EVs 则效果不明显。在体内实验中，将不同浓度的 M1 - EVs 注射到怀孕小鼠子宫内，发现 M1 - EVs 能够穿过母胎屏障，且其浓度与胎膜早破的发生时间呈正相关。免疫荧光分析和 western blot 分析表明，M1 - EVs 影响了 AECs 的 EMT 过程，导致羊膜的生物力学性能下降，最终引发胎膜早破。
7. M1 - EVs 对人类羊膜的影响：研究人员收集了患有细菌性阴道炎诱导的胎膜早破孕妇的羊水和羊膜样本，与剖宫产孕妇的样本作为对照。分析发现，胎膜早破孕妇羊水中巨噬细胞比例显著增加，PROM - AF - EVs 中 miR - 146a/155 表达显著高于 Normal - AF - EVs。对羊膜样本的分析显示，PROM - AM 细胞中 NUMB、EHF 和 ECAD 水平显著降低，而 EMT 相关基因表达上调。将从正常羊水中提取的 CD14 阳性巨噬细胞极化为 hM1 巨噬细胞，并用其来源的 hM1 - EVs 处理正常羊膜，结果与小鼠实验一致，hM1 - EVs 导致羊膜细胞间连接破坏，细胞间隙增大，羊膜的杨氏模量降低。这表明 M1 - EVs 诱导 AECs 发生 EMT 并降低羊膜生物力学性能的机制在人类中同样适用。

综合上述研究结果，研究人员得出结论：在炎症条件下，M1 巨噬细胞来源的 EV - miR - 146a/155 能够触发 AECs 发生 EMT，并促进 MMP - 9 转录，从而增加了小鼠和人类胎膜早破的风险。具体来说，EV - miR - 155 抑制 Ehf 表达，减少 E - cadherin 转录；EV - miR - 146a 激活 β - catenin/Tcf7 复合体，促进 Snail、MMP - 9 和 miR - 146a/155 的转录，诱导 EMT 发生。AECs 发生 EMT 后，细胞间连接被破坏，细胞间隙增大，羊膜的生物力学性能恶化，最终导致胎膜破裂。

这项研究意义重大，它揭示了胎膜早破发病机制中 M1 巨噬细胞来源的 EVs 与 AECs 之间的关键调控关系，为理解胎膜早破的病理过程提供了新的视角。这一成果有助于开发针对胎膜早破的新型诊断方法和治疗策略，有望为降低胎膜早破的发生率、改善母婴预后带来新的希望，在生命科学和健康医学领域具有重要的理论和实践价值。