增强纳豆激酶热稳定性的理性设计：开启心血管疾病治疗新可能

研究人员为解决纳豆激酶热稳定性差的问题，开展二硫键理性设计研究，提高其热稳定性和活性，意义重大。

　　纳豆，这种在日本饮食中常见的发酵大豆食品，近年来在健康领域备受瞩目，原因就在于它含有一种特殊的成分 —— 纳豆激酶（Nattokinase）。纳豆激酶具有强大的溶栓作用，自从 1987 年被发现以来，就被科学界视为预防和治疗心血管疾病的潜力药物。想象一下，血管就像城市里的交通干道，血栓则是路上突然出现的大型障碍物，严重影响血液的正常流动。而纳豆激酶就如同高效的清障车，能够清除这些血栓，保障血管的畅通。

然而，在将纳豆激酶应用于实际的食品和制药领域时，却遇到了重重阻碍。其中最突出的问题就是它的热稳定性较差。目前，纳豆激酶主要以酶制剂的形式作为保健品推向市场。在生产过程中，酶的干燥和造粒环节需要短暂的高温处理（170℃），但纳豆激酶却无法承受这样的温度，这极大地限制了它的工业化生产和市场应用，就像给一辆性能强大的汽车装上了一个脆弱的发动机，无法发挥其全部实力。

为了解决这一难题，新疆大学药学院药物研究所、生命科学与技术学院新疆生物资源与遗传工程重点实验室等机构的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们的研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上，为纳豆激酶的工业化生产和应用带来了新的曙光。

研究人员采用了多种关键技术方法来开展这项研究。首先是定点突变技术，通过设计特定的引物对纳豆激酶基因进行突变，构建出不同的突变体。然后运用生物信息学分析，预测蛋白质结构、分析氨基酸序列保守性等，筛选出可能形成二硫键的位点。分子动力学模拟技术也发挥了重要作用，它可以模拟蛋白质在不同条件下的动态变化，深入探究热稳定性增强的分子机制。此外，研究人员还对突变体的发酵过程进行优化，以提高纳豆激酶的产量。

下面来看看具体的研究结果：

1. 二硫键的理性设计：研究人员利用 Disulfide by Design 2.0 软件设计纳豆激酶的二硫键，经过多轮筛选，最终确定了两个突变体 50–109（M1）和 15–271（M2）。筛选过程就像是在一个庞大的基因库中精准地找到宝藏，他们综合考虑了突变位点与催化活性中心的距离、β - 碳原子间距、氨基酸残基的保守性以及蛋白质结构的灵活性等多个因素1。
2. 突变体的纯化和表征：通过定点突变构建的 M1 和 M2 突变体在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中成功表达。研究发现，M1 和 M2 突变体均形成了二硫键，且在 55℃下的半衰期分别是野生型的 2.50 倍和 5.17 倍，热稳定性显著提高。同时，它们的比酶活性也分别提高了 2.37 倍和 1.66 倍，这意味着突变体在催化反应中的效率更高。此外，将两个突变体结合，纳豆激酶的热稳定性提高了 8.0 倍23。
3. 突变体催化性能增强的机制：借助 AlphaFold2 预测蛋白质结构，并进行分子动力学模拟分析。结果表明，M1 和 M2 突变体热稳定性增强是由于整体结构的刚性增加和结构收缩。在分子动力学模拟中，通过均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、溶剂可及表面积（SASA）和回转半径（Rg）等指标来表征蛋白质的稳定性。突变体的 RMSD 值显著降低，Rg 和 SASA 值减小，说明其结构更加紧密稳定。此外，突变还影响了蛋白质活性中心的构象，使底物与活性中心的结合更加紧密，从而提高了催化活性45。
4. 发酵过程优化提高 M1 突变体产量：研究人员比较了五种大肠杆菌工程菌株对 M1 突变体表达的影响，发现大肠杆菌 Shuffle T7 菌株最有利于 M1 突变体的异源表达。进一步对发酵条件进行单因素优化和正交实验，确定了最佳发酵条件为装瓶量 20%、pH 7、诱导温度 20℃、诱导时间 18h。在该条件下，M1 突变体的酶产量比优化前提高了 2.16 倍67。

在研究结论和讨论部分，研究人员成功探索出了提高纳豆激酶催化性能的有效策略。对于酶活性和热稳定性都得到改善的 M1 突变体，筛选出了最高蛋白产量的宿主菌株，并优化了发酵条件。这些成果对纳豆激酶的大规模生产具有重要的指导意义，使其具备了潜在的工业生产和应用价值。这不仅为纳豆激酶提供了新的口服剂型，而且与其他药物联合使用时，可能为血栓形成倾向或心血管疾病的治疗提供新的选择，为心血管疾病患者带来了新的希望。这项研究就像是一把钥匙，打开了纳豆激酶在医药领域广泛应用的大门，相信在未来，它将在保障人类健康方面发挥更大的作用。