敲除 MNN11 基因：优化马克斯克鲁维酵母异源蛋白分泌的新策略

为探究 N - 糖基化突变对马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）异源蛋白分泌影响，研究人员敲除 MNN11 基因，发现其可增强蛋白分泌，补充有机氮源能缓解生长缺陷，为优化表达提供策略。

　　在微观的细胞世界里，酵母作为一种神奇的微生物，一直以来都是科研人员关注的焦点。酵母能够生产各种有用的蛋白质，在工业生产、生物医药等领域发挥着重要作用。然而，在酵母生产异源蛋白（即原本不属于酵母自身的蛋白质）的过程中，却存在一些棘手的问题。

N - 糖基化（N-glycosylation）是真核生物中普遍存在的一种蛋白质翻译后修饰方式，就像给蛋白质穿上了一件 “糖衣”，它对蛋白质的分泌有着至关重要的调节作用。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，研究人员发现一些糖基化突变体能够提高异源糖基化蛋白的分泌。但是，还有许多谜团尚未解开：这些突变体是否也能促进非糖基化蛋白的分泌呢？糖基化突变带来的细胞生长缺陷问题又能否得到解决呢？而且，对于非传统酵母在糖基化缺陷方面的研究还非常有限。

为了攻克这些难题，复旦大学的研究人员展开了一项意义重大的研究。他们将目光聚焦在马克斯克鲁维酵母（K. marxianus）上，这种酵母在乳制品中极为常见，并且被认为是食品安全级别的微生物，具有生长迅速、耐高温、底物利用范围广等诸多优点，是生产生物乙醇、化学品和异源蛋白的理想 “细胞工厂”。研究人员通过一系列实验，筛选出了能够增强马克斯克鲁维酵母异源蛋白表达的突变体，其中敲除糖基化基因 MNN11 的突变体表现尤为突出。该研究成果发表在《Microbial Cell Factories》杂志上。

研究人员在此次研究中，主要运用了以下几种关键技术方法：一是构建质粒和菌株，将相关基因插入质粒，转化酵母菌株，得到不同的突变体和过表达菌株；二是进行酶活性测定和 SDS-PAGE 分析，以此来检测异源蛋白的分泌情况；三是开展转录组测序（RNA-seq）及数据分析，探究基因表达的变化；四是进行细胞生长曲线测定和斑点实验，研究细胞的生长情况；五是实施高细胞密度发酵实验，模拟工业生产环境，验证实验结果的实用性。

研究结果如下：

1. 筛选增强分泌表达的基因：研究人员从文献中挑选出 17 个候选基因，这些基因在酿酒酵母中的同源基因敲除或过表达后，被证明会影响蛋白分泌。实验结果显示，8 个敲除突变体（mnn11Δ、cwh41Δ、flc1Δ、gds1Δ、trm1Δ、ybl081wΔ、gag1Δ、ank1Δ）显著提高了 α- 半乳糖苷酶 Mel1 的活性；5 个敲除突变体（mnn11Δ、cwh41Δ、ybl081wΔ、ank1Δ、ubx2Δ）提高了阿魏酸酯酶 AnFaeA 的活性。其中，mnn11Δ 突变体对 Mel1 和 AnFaeA 活性的提升最为显著，不过该突变体也出现了明显的生长缺陷12。
2. MNN11 基因敲除对蛋白分泌的影响：为了探究 mnn11Δ 突变体促进分泌表达的普遍性，研究人员测试了 5 种不同酶的分泌情况，包括糖基化的葡萄糖淀粉酶 BadGLA、内切木聚糖酶 Xyn-CDBFV，以及非糖基化的内切甘露聚糖酶 MAN330、壳聚糖酶 SpChi1 和内切葡聚糖酶 RuCelA。结果发现，与野生型菌株相比，mnn11Δ 突变体使这些酶的分泌活性分别提高了 176%、43%、130%、668% 和 62%，这表明 mnn11Δ 突变体对糖基化和非糖基化蛋白的分泌均有促进作用。此外，研究人员还发现，敲除 MNN11 基因会影响甘露糖聚合酶 II（M-Pol II）复合物的活性，导致糖基化外链延伸缺陷，蛋白分子量降低。同时，研究人员构建了 mnn10Δ、mnn10Δ mnn11Δ 等突变体，对比发现 MNN11 基因敲除对蛋白分泌的促进效果优于 MNN10 基因敲除，且双敲除并未产生正向协同效应345。
3. mnn11Δ 突变体的作用机制：通过转录组分析，研究人员发现 mnn11Δ 突变体在生长 24 小时和 48 小时后，分别有 1428 个和 1744 个差异表达基因（DEGs）。这些差异表达基因主要富集在与能量供应、蛋白质合成和分泌相关的过程中，如线粒体翻译、碳水化合物代谢、蛋白质输出和 SNARE 相互作用等。此外，mnn11Δ 突变体还表现出对氨基酸的高需求，其液泡膜上的氨基酸转运蛋白和 V-ATP 酶显著上调，参与氨基酸生物合成和跨质膜运输的基因也明显上调67。
4. 有机氮源对 mnn11Δ 突变体生长的影响：在工业生产中，培养基的成本和细胞的生长速度至关重要。研究人员比较了野生型和 mnn11Δ 细胞在不同培养基中的生长情况，发现 mnn11Δ 细胞在以无机氮源为主的合成矿物（SM）培养基中生长缺陷明显。而补充氨基酸或低浓度的酵母提取物（YE）能够有效缓解 mnn11Δ 突变体的生长缺陷，这表明 mnn11Δ 突变体的生长缺陷与氨基酸供应不足密切相关。进一步研究发现，补充 YE 不仅能缓解生长缺陷，还能减轻细胞的细胞壁缺陷8910。
5. 酵母提取物对 mnn11Δ 突变体高密发酵的影响：为了验证在 SM 培养基中补充有机氮源在工业生产中的可行性，研究人员进行了高细胞密度发酵实验。结果显示，补充 YE 能有效缩短 mnn11Δ 突变体的延迟期，使其更快进入指数生长期，并且显著提高了 Mel1、Xyn-CDBFV 和 RuCelA 的分泌活性。不过，添加 YE 也会增加成本并给下游蛋白质纯化带来问题，研究人员指出，在某些情况下，可以根据实际需求选择合适的氮源来解决这些问题111213。

综上所述，该研究表明，糖基化突变是提高马克斯克鲁维酵母异源蛋白分泌表达的有效策略。敲除 MNN11 基因能够增强糖基化和非糖基化蛋白的分泌，这主要是通过上调关键的分泌过程实现的。mnn11Δ 突变体在合成培养基中生长缺陷的原因是氨基酸短缺，补充低浓度的有机氮源可以缓解这一缺陷，同时提高异源蛋白的表达。由于大多数糖基化突变体都存在类似的氨基酸短缺和细胞壁缺陷问题，因此补充有机氮源的策略有望应用于优化其他糖基化突变体的表达。这一研究成果为酵母异源蛋白生产领域提供了新的思路和方法，具有重要的理论意义和应用价值。