基于 RNA toehold switch 的报告分析：解锁细菌摄取反义寡聚体的奥秘，助力抗菌疗法新突破

这篇研究开发了一种 “开启式” 报告分析方法（RNA toehold switch-based reporter assay），能半定量检测反义寡聚体（ASO）的摄取效率。通过筛选不同细胞穿透肽（CPPs）作为 ASO 载体，为发现高效 ASO 载体提供工具，有望推动新型抗菌疗法的发展。

　　### 引言
抗菌耐药性是全球健康面临的重大挑战，基于可编程物种特异性 RNA 的抗菌药物是传统抗生素的潜在替代品。反义寡聚体（ASO）能靶向细菌 mRNA，抑制关键基因表达，从而导致细菌死亡或恢复抗生素活性 。目前抗菌 ASO 多基于肽核酸（PNA）或磷酰胺吗啉代寡聚物（PMO），但 ASO 需借助载体进入细菌细胞质 。现有评估 ASO 载体递送潜力的方法存在局限性，因此本文开发了一种基于翻译 “开启” 的报告分析方法，用于评估 ASO 进入细菌细胞质的递送情况。

结果

1. PNA 介导的 RNA toehold switch 体外激活：研究构建了基于 TS7 toehold switch 的 ASO 传感器，通过体外翻译实验，发现 11mer 的 PNA_toe 能剂量依赖性地激活 TS7 RNA toehold switch，促使融合报告蛋白合成，而非靶向 PNA（PNA_ctrl）则无此作用。
2. PNA 递送体内激活 toehold switch：在鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）中建立报告分析体系，用 (KFF)₃K（KFF）作为载体递送 PNAs。结果显示，PNA_toe 和 PNA_mid 均能使荧光浓度依赖性增加，且 PNA_toe 激活效果更好、毒性更低，因此选择 PNA_toe 用于后续实验。通过流式细胞术进一步验证，发现荧光变化具有浓度和时间依赖性，且确定 5 μM 为后续实验的最佳浓度。
3. 改进的 toehold switch 增强 PNA 介导的激活：对 toehold switch 的茎部进行突变，发现突变位置 9（TS7-Mut_9）的构建体在 PNA 处理后能实现约 50 - 60 倍的激活，高于原始序列，因此选择 TS7-Mut_9 进行后续实验。
4. 生长培养基和荧光蛋白对报告激活的影响：比较不同培养基对报告激活的影响，发现 KFF-PNA_toe 在 MHB 和 M9 培养基中能触发约 50 - 60 倍的激活，而在 LB 培养基中仅为 6 - 8 倍。同时，测试不同荧光蛋白，结果表明 sfGFP 作为报告蛋白时，在 4 h 和 6 h 的上调倍数最高，因此继续使用 sfGFP 作为报告蛋白。
5. toehold switch 报告可洞察 CPP-PNA 摄取机制：利用沙门氏菌 ΔsbmA突变株验证报告系统与 PNA 摄取的相关性，结果显示，在 ΔsbmA突变株中，KFF-PNA_toe 触发的 GFP 表达显著降低，表明该报告系统可用于评估细菌转运蛋白在 PNA 递送中的作用。
6. toehold switch 报告可评估 CPP 介导的 PNA 递送：应用报告分析方法测试 10 种 CPPs 递送 PNA_toe 的能力，结果显示 KFF、RXR 和 ANT 在荧光增加方面表现突出，Seq23 效果最差。在大肠杆菌（E. coli）中进行验证，发现不同菌株对 CPP-PNA 的响应存在差异，且 K12 菌株的荧光信号低于 UPEC 536。
7. 流式细胞术显示 toehold switch 激活的动态差异：通过流式细胞术在不同时间点检测荧光，发现 KFF、RXR 和 ANT 在 4 h 时荧光快速上调，而 Seq35、Seq118 等在 17 h 才出现上调。同时，不同 CPPs 介导的 PNA 递送在不同菌株中的动态变化存在差异。
8. 报告激活与抗菌 CPP-PNA 共轭物活性相关：测定 CPPs 与靶向acpP mRNA 的抗菌 PNA 共轭物的最小抑菌浓度（MIC），发现报告分析中荧光上调明显的 RXR、KFF 和 ANT，其 MIC 较低，表明报告激活与抗菌活性总体相关，但也存在不一致的情况。

讨论

1. “开启式” 报告系统的优势与应用前景：开发的 “开启式” 报告系统可用于研究 ASO 摄取及 CPP-PNA 转运机制，是一种简单且半定量的方法，有望发展为高通量筛选平台。同时，该系统表明 toehold switch 可被生物稳定的 RNA 模拟物激活，在合成生物学中具有潜在应用价值。
2. 报告系统揭示的 CPP-PNA 递送动态差异：对 10 种 CPPs 的筛选发现，不同 CPPs 介导的 PNA 递送在荧光上调模式上存在差异，这与 CPPs 的化学性质和稳定性有关。例如，KFF 在培养基中易被蛋白酶降解，导致荧光先升后降；而 RXR 由于其特殊结构，具有抗蛋白酶降解的能力，荧光持续增加。这些差异有助于了解 CPP 在细菌培养中的稳定性以及 PNA 的递送动力学。
3. 报告分析方法的局限性与优化策略：该方法在不同细菌菌株中的动态范围存在差异，如在大肠杆菌 K12 菌株中的灵敏度低于沙门氏菌和 UPEC 536 菌株，可能与细菌包膜组成不同有关。为提高灵敏度和动态范围，可优化 toehold switch 和激活 ASO 序列，如对 TS7 序列进行突变筛选，或尝试使用更长的 PNAs。同时，考虑 ASO 与 RNA 的结合亲和力、熔解温度（T_m）等因素，也有助于优化报告分析方法。此外，使用不同荧光蛋白评估质粒拷贝数变化和 CPP-ASO 毒性，以及针对不同细菌优化实验条件，可进一步完善该方法。

展望

该分析方法可用于高通量发现新型 ASO 载体，拓展到其他载体类型，如纳米颗粒和铁载体等。这将有助于使用更多类型的 ASO 骨架，如 2′-4′碳桥连锁核酸（LNA）和 2?-O - 甲氧基乙基（2?-MOE），从而扩大针对微生物的 ASO 化学空间，为精准操纵细菌群落和开发新型抗菌疗法提供支持。

材料与方法

1. 材料准备：介绍实验所用的细菌菌株、培养基、PNAs 和肽共轭 PNAs（CPP-PNAs）的来源及处理方法。
2. 体外转录：通过重叠聚合酶链反应（PCR）生成用于 T7 RNA 聚合酶介导的体外转录模板，然后进行体外转录，制备用于后续实验的 RNA。
3. 体外翻译和蛋白质印迹：使用 PURExpress 体外蛋白质合成试剂盒进行体外翻译，通过蛋白质印迹检测翻译后的蛋白量，评估 PNA 介导的报告翻译激活情况。
4. 构建翻译 TS7 报告质粒：从 Addgene 质粒扩增 TS7 序列，克隆到 pXG10-SF 载体中，构建不同荧光蛋白融合的报告质粒，并对 toehold switch 进行单核苷酸突变。
5. CPP-PNA 处理细菌及检测：用 CPP-PNAs 处理细菌，在不同时间点检测荧光强度和细菌生长情况，通过流式细胞术和蛋白质印迹进一步分析。
6. 最小抑菌浓度测定：采用肉汤微量稀释法测定 CPP-PNAs 的最小抑菌浓度（MIC）。