编辑推荐：
来自内蒙古医科大学等的研究人员，为深入解析酰基肉碱（CARs）结构，联用 PB-MS/MS 和 EAD 技术，优化检测条件，提升检测灵敏度，为相关疾病研究提供助力。
酰基肉碱（CARs）在将酰基从细胞质转运到线粒体基质进行 β- 氧化过程中发挥着关键作用，它是细胞活动的主要能量来源。生物样本中 CARs 的组成和水平，能够反映个体的代谢状态，长期以来，它一直是诊断脂肪酸氧化先天性缺陷以及评估能量代谢缺陷的重要标志物。CARs 代谢失调与多种代谢疾病密切相关，如肥胖、2 型糖尿病（T2D）、心血管疾病和肝细胞癌等。
CARs 由脂肪酸辅酶 A（fatty acyl-CoAs）和肉碱在肉碱酰基转移酶（CAT）的催化作用下结合而成。其结构具有多样性，这源于脂肪酸链长度、不饱和程度的差异，以及多种链内修饰，包括碳 - 碳双键（C=C）、羟基和羧基取代基等。人类代谢组数据库（HMDB）总共收录了 1240 种独特的 CARs 结构。在人体血浆中，各种 CARs 的总浓度约为 10 - 25 μM，并且还能进一步细分为更多结构明确的种类。因此，生物样本中单个种类的 CARs 含量相对较低，例如中链 CARs 的浓度低于 0.5 μM。
在先前的研究中发现，在液相色谱（LC）系统的流动相中添加碳酸氢铵（NH?HCO?），能够提高磷脂酰胆碱（PC）的质谱（MS）检测信号。此外，Wang 等人近期的研究表明，NH?HCO?缓冲液还能显著提升溶解在纯水中的 5 - 羟甲基胞嘧啶（5hmC）的 MS 检测信号。这一现象被认为是由于碳酸氢根阴离子与这些分子中的胺基具有较强的结合亲和力。鉴于 CARs 含有季铵基团，研究人员推测在 LC - MS 分析中，将 NH?HCO?作为流动相缓冲液，也能够提高 CARs 的检测灵敏度。
质谱（MS）是一种强大的分析技术，可用于鉴定和定量生物样本中的 CARs 种类。利用质谱仪的高分辨率能力，能够根据精确质量区分质量差异微小的同量异位 CARs。在串联质谱（MS/MS）的碰撞诱导解离（CID）过程中，CARs 会呈现出特征性的碎片模式，如 m/z 60.080、m/z 85.028、m/z 144.101，以及三甲胺部分（m/z 59.073，NH (CH?)?）的中性丢失。此外，m/z 145.049 的碎片离子表明存在 3 - 羟基共轭酰基肉碱，而在二羧基共轭 CARs 中，常常能观察到由于脂肪酸链上羧基丢失产生的 m/z 46.005 的碎片离子。这些碎片离子为利用 MS/MS 技术解析和区分 CARs 的结构提供了重要信息。
为了提高酰基肉碱的检测覆盖率，科研人员付出了诸多努力，例如将 MS 与液相色谱（LC）联用，以及进行特定的衍生化反应，以此提升异构体分离能力、检测灵敏度和选择性。利用高分辨率平行反应监测（PRM）液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）技术，已经能够在血浆、尿液和组织样本中鉴定出数百种 CARs。这些全面的研究结果，为生物样本中 CARs 的注释和鉴定提供了宝贵的参考数据。近期，超高效液相色谱 - 串联质谱（UHPLC - MS/MS）技术实现了在 10 分钟内一次运行对数百种酰基肉碱的定量分析。尽管取得了这些进展，但针对获取 CARs 详细结构信息（如碳 - 碳双键（C=C）的位置、甲基支链和羟基的位置）的研究仍然较少。
目前已经开发出几种替代的 MS/MS 方法，用于更深入地解析脂质结构。研究表明，通过自由基导向解离（RDD）的 MS/MS 技术，能够有效地诱导链内碎片化，从而确定脂肪酸链上修饰基团（如羟基和甲基支链）的位置。此外，气相离子活化方法，如电子诱导解离（EID）/ 有机物离子的电子碰撞激发（EIEIO）、紫外光解离（UVPD）和气相电荷反转离子 / 离子反应等，也被用于表征完整磷脂中 C=C 的位置和 sn - 位置。对双电荷脂质 - 金属离子复合物进行碰撞诱导解离，能够确定饱和游离脂肪酸（FAs）和甘油磷脂（GPs）中支链的位置。近期，点击反电子需求狄尔斯 - 阿尔德反应首次被用于确定 FAs 和 GPs 中 C=C 键的区域化学。然而，这些方法尚未应用于 CARs 的详细结构分析。
在这项研究中，研究人员开发了一种联用 MS/MS 的方法，用于对 CARs 进行深入的结构表征。该方法结合了两种技术：一是利用 PB - MS/MS 技术确定 C=C 的位置；二是在 ZenoTOF 7600 质谱仪上采用电子激活解离（EAD）技术，确定甲基支链和羟基的位置。基于优化的 LC 条件和深度剖析的 MS/MS 策略，研究人员建立了一种能够灵敏且全面地表征 CARs 种类的工作流程。通过分析小鼠血浆中的极性脂质提取物，对该工作流程进行了评估，并进一步将其应用于监测 T2D 小鼠血浆样本中，相对于正常对照组，CARs 的支链异构体和 C=C 位置异构体的变化。
实验部分：
- 化学试剂和材料：酰基肉碱标准品购自 Avanti Polar Lipids, Inc.（美国阿拉巴马州阿拉巴斯特）。关于标准品以及其他化学试剂和溶剂的详细信息，在支持信息中提供。所有野生型（WT）C57BL/6J 小鼠均来自内蒙古医科大学，2 型糖尿病 C57BL/6J 小鼠购自北京斯贝福生物技术有限公司。所有动物的饲养均遵循相关指南。
- 碳酸氢铵增强 LC - MS 对酰基肉碱的检测：酰基肉碱通过反相 C18 柱洗脱，并在正离子模式下进行 MS 检测。研究人员通过比较酰基肉碱的提取离子色谱图（XIC）和 MS1 谱图，展示了流动相中不同铵添加剂对酰基肉碱检测灵敏度的影响。数据采集使用的是三重四极杆 / 线性离子阱（LIT）混合型质谱仪（6500 QTRAP，Sciex，加拿大多伦多），在流动相中分别添加 10 mM 的 NH?COOH、CH?COONH?或 NH?HCO?缓冲液。
结论：在本研究中，研究人员优化了 LC 的流动相条件，以实现对 CARs 的灵敏检测，并提供了一种联用方法，用于表征 CARs 中的甲基支链和 C=C 位置。与常用的缓冲液 NH?COOH 和 CH?COONH?相比，在 LC 系统的流动相中添加 NH?HCO?，提高了 CARs 的信号，并使检测限降低了约 10 倍。研究数据表明，由 EAD 引发的链内碎片能够解析 CARs 的精细结构。
作者贡献声明：Xiangyu Gao 负责撰写原始草案、验证、调查和数据整理；Chunli Liu 负责验证、调查和数据整理；Xue Zhao 负责撰写评审和编辑、监督、方法学以及获取资金支持。
利益冲突声明：作者声明，他们不存在已知的可能影响本文所报道研究工作的财务利益或个人关系冲突。
致谢：本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：22304088）和内蒙古自治区自然科学基金（项目编号：2023QN02002）的资助。
