适应性进化提升酿酒酵母产酪醇产量的机制解析与菌株改良

研究人员针对酿酒酵母产酪醇时生长受限问题，开展适应性进化研究，获高产菌株 S26-AE2，为代谢工程提供理论依据。

　　在生命科学的微观世界里，有一种神奇的物质 —— 酪醇（Tyrosol），它可不简单！作为药物前体，酪醇具有抗癌、抗氧化和抗炎等多种强大的药用活性，广泛存在于橄榄油、葡萄酒和植物组织中。目前，酪醇的商业生产主要依赖化学合成和橄榄叶提取这两种方法。然而，橄榄叶提取面临着效率低、资源依赖度高的困境，化学合成又不够环保。相比之下，利用微生物细胞工厂生产酪醇，不仅成本低、环境友好，还可持续。其中，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）成为了生产酪醇的热门微生物。

不过，科研人员在利用酿酒酵母生产酪醇的过程中遇到了难题。虽然对酿酒酵母进行代谢改造能提高酪醇产量，但过多的代谢修饰会导致酵母生长速度下降，这严重限制了其在发酵罐和工业生产中的应用。为了解决这一问题，湖北工业大学等机构的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们通过适应性实验室进化（ALE）技术，成功获得了一株生长性能良好且酪醇产量高的菌株 S26-AE2，并深入解析了其进化机制。该研究成果发表在《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》上，为酿酒酵母合成酪醇及其衍生物的代谢工程提供了重要的理论基础。

研究人员为开展此项研究，主要运用了以下几种关键技术方法：首先是适应性实验室进化技术，以酿酒酵母 S26 为起始菌株，在葡萄糖浓度逐渐增加的环境下进行进化培养；其次是转录组分析技术，对进化前后的菌株进行转录组测序，分析基因表达变化；还有单核苷酸多态性（SNP）分析技术，检测进化菌株的基因突变；另外，利用 CRISPR-Cas9 位点定向诱变技术对筛选出的突变基因进行功能验证，以及分子对接技术研究蛋白质与小分子的相互作用。

下面来看具体的研究结果：

1. 适应性实验室进化改善酿酒酵母生长表型：研究人员对酿酒酵母 S26 进行适应性实验室进化，在进化过程中逐步提高葡萄糖浓度。进化过程分为三个阶段，获得了 S26-AE1、S26-AE2 和 S26-AE3 三株进化菌株。通过扫描电子显微镜观察酵母细胞形态，发现 S26-AE1 有少量细胞损伤，S26-AE2 细胞损伤明显，而 S26-AE3 未出现更多损伤。斑点试验表明，进化菌株在含 20g/L 和 100g/L 葡萄糖的培养基中生长情况优于原始菌株，说明适应性实验室进化有利于改善菌株生长。
2. 进化菌株发酵性能的变化：在添加 100g/L 葡萄糖的 YEPD 培养基中培养原始菌株 S26 和进化菌株，结果显示 S26-AE2 和 S26-AE3 进入稳定期的时间比原始菌株更早，且 S26-AE2 的生物量比 S26 高 15.33%。在酪醇产量方面，S26-AE2 的酪醇产量显著提高，在 48h 时达到 817.83mg/L，比 S26 最高产量高 69.20%。此外，研究人员还检测了葡萄糖消耗、乙醇、甘油和海藻糖的产生等指标，发现进化菌株能更快地消耗葡萄糖，且海藻糖和甘油的产量降低，表明进化菌株逐渐适应了在 100g/L 葡萄糖培养基上生长。
3. 转录组分析揭示 S26-AE2 产酪醇增加的机制：对 S26 和 S26-AE2 进行转录组分析，研究人员发现，与 S26 相比，S26-AE2 在代谢途径相关基因的表达上存在显著差异。在葡萄糖代谢方面，S26-AE2 中 HXT5 基因表达增加，HXK2 基因表达降低，这可能减少了细胞对葡萄糖抑制的转录调控，促进了葡萄糖的利用。参与丙酮酸合成的基因表达增加，使 S26-AE2 可能增加丙酮酸的产生。在三羧酸循环（TCA cycle）中，大多数相关基因在 20g/L 葡萄糖条件下表达上调，且 S26-AE2 中的表达水平明显高于 S26，表明进化菌株的 TCA 循环更活跃，这有助于细胞生长和能量生成。此外，参与酪醇合成途径的 ARO3、ARO4 等基因表达增加，促进了酪醇的合成。
4. 适应性实验室进化菌株 S26-AE2 的 SNP 突变分析：对进化菌株 S26-AE2 进行基因测序，研究人员获得了 SNP 相关信息，发现 SNP 主要发生在 CM001525.1 和 CM001529.1 染色体上。经过筛选分析，确定了 5 个发生 SNP 突变的基因，分别为 MAL32、SNZ3、DOT6、HXT3 和 PHO3。
5. SNZ3 和 PHO3 突变体与小分子结合的分子对接分析：通过分子对接模拟，研究人员发现 PHO3^Asn134Asp突变后，其与小分子物质硫胺素磷酸的亲和力提高；SNZ3^Val125Ile突变后，与小分子 D - 核糖 5 - 磷酸的相互作用发生变化。这些变化可能影响相关代谢过程。
6. 反向工程验证提高酵母生长和稳健性：利用 CRISPR-Cas9 位点定向诱变技术，研究人员获得了 S26-PHO_3Mut、S26-SNZ_3Mut和 S26-PHO₃^Mut+SNZ₃^Mut三株突变菌株。实验结果表明，在 100g/L 葡萄糖培养基中，SNZ3 突变能促进酵母产生酪醇，其产量比对照菌株 S26 增加了 17.01%。这说明 SNZ3 的单核苷酸突变可提高酪醇浓度。

综合研究结论和讨论部分，研究人员通过适应性进化恢复了高产酪醇菌株 S26 的生长，转录组分析揭示了进化菌株 S26-AE2 与原始菌株在糖酵解、TCA 循环和酪醇合成途径等方面基因表达的差异。分子对接和反向工程验证了 SNZ3^Val125Ile突变在提高酪醇产量方面的有效性。不过，研究也指出并非所有突变都有益，如酿酒酵母的 PHO6 突变体就存在营养缺陷问题。总体而言，该研究为酿酒酵母合成酪醇及其衍生物的代谢工程改造提供了坚实的理论依据，有助于推动利用微生物生产酪醇的工业化进程，在生物燃料和生物产品领域具有重要的应用价值。