斑马鱼创伤应激行为研究中同种警报物质（CAS）供体数量的影响

斑马鱼是研究压力和焦虑的重要模型，本文探讨了不同数量 CAS 供体对其创伤相关行为的影响。

　　

斑马鱼：压力与焦虑研究的新兴模型

在生命科学和健康医学领域，压力相关研究一直是热门话题。适度的压力是生物体生存的正常适应性生理反应，但过度压力会引发一系列问题，如在人类中，创伤暴露可能导致神经精神疾病，像焦虑症、抑郁症和创伤后应激障碍（PTSD）等。

由于研究人类压力存在伦理和方法上的限制，科研人员常常借助临床前模型系统来深入探究压力机制。在众多模型中，斑马鱼（Danio rerio）逐渐崭露头角，成为研究压力和焦虑的重要生物模型。斑马鱼在幼年和成年阶段，都与哺乳动物在遗传、解剖和生理上有着广泛的同源性。例如，它们拥有与哺乳动物下丘脑 - 垂体 - 肾上腺（HPA）轴组织和功能相似的下丘脑 - 垂体 - 间肾（HPI）轴，并且在压力反应中，与人类一样，皮质醇和去甲肾上腺素发挥着关键作用。此外，斑马鱼的压力相关行为表现丰富且易于量化，比如它们会表现出亮处回避、受惊冻结、底部栖息和趋触性等焦虑样行为，同时也存在对焦虑刺激有抗性且表现出高风险行为的亚群。

同种警报物质（CAS）：斑马鱼压力研究的关键因素

在鱼类的生存策略中，警报信号的传递至关重要。斑马鱼能通过释放同种警报物质（CAS）向同伴传达危险信息。CAS 是由受伤鱼的表皮细胞合成，当细胞受损时释放，周围的斑马鱼可通过嗅觉感知。在实验室研究中，CAS 常被用作生化应激源来研究焦虑相关行为。不过，目前关于 CAS 的研究存在一些不确定性。虽然近期研究揭示了其化学组成，发现 ostariopterin 和 daniosulfate（也称为 5α - cyprinol sulfate 和 5α - daniol sulfate）的并行检测是引发斑马鱼典型警报反应的原因，但从行为学角度看，受伤程度或受伤鱼数量对斑马鱼创伤相关行为的影响尚不明确。而且，现有研究在 CAS 提取方法上差异较大，尤其是供体斑马鱼数量不同，这使得研究结果难以比较，数据也不一致。

实验设计：探究 CAS 供体数量对斑马鱼行为的影响

为了深入了解不同数量的 CAS 供体对斑马鱼创伤相关行为的影响，研究人员开展了一项精心设计的实验。实验选用了 240 只野生型长鳍斑马鱼，其中包括 120 只幼年斑马鱼（30 ± 3 dpf，标准长度约 10 mm）和 120 只成年斑马鱼（3 - 5 个月大，标准长度约 30 - 40 mm），另外还有 50 只成年斑马鱼作为 CAS 供体，24 只虎皮鱼（Puntigrus tetrazona）用于测试成年斑马鱼的风险行为。

实验前，斑马鱼被精心饲养。幼鱼在特定条件下孵化和培育，每天更换部分 E3 培养基，不同阶段投喂不同食物。成年鱼则从饲养库存中选取，饲养在特定条件的水箱中，每天定时投喂。所有斑马鱼都保持 12 小时光照 / 黑暗的循环。

在实验设计上，斑马鱼被随机分为不同组。实验前一天，幼年斑马鱼被转移到 3 - L 的饲养水箱，成年斑马鱼被转移到 8 - L 的新水箱。每个年龄组都设置了一个对照组（无压力暴露），其余四组则在承受不同程度创伤应激的同时，接触不同浓度的 CAS，这些 CAS 分别从 1、4、8、12 条供体斑马鱼中提取。实验第一天，斑马鱼接受相应的处理，第二天进行行为测试。幼年斑马鱼进行明暗测试（LDT）和开放场测试（OFT），成年斑马鱼进行新颖水箱测试（NTT）和新颖开放场测试（nOFT）。测试结束后，斑马鱼被安乐死。

实验方法：多维度的研究手段

1. 创伤应激方案：研究人员为幼年和成年斑马鱼设计了不同的创伤应激方案。对于幼年斑马鱼，将其置于特定容器中进行 50 分钟的拥挤处理，随后转移到暴露水箱中的圆形筛网内，水箱中加入相应浓度的 CAS 和安乐死的供体鱼，接着进行机械搅拌、排水和空气暴露等操作。成年斑马鱼则先在暴露水箱中拥挤 50 分钟，然后加入 CAS 提取物和供体鱼，排水后施加一次电击，最后进行空气暴露。
2. CAS 提取：由于缺乏标准化的 CAS 提取方法，研究人员参考了以往的研究。在每次实验前，从相应数量的供体斑马鱼中新鲜提取 CAS。具体步骤包括安乐死供体鱼、在鱼体两侧切开伤口、加入 10 mL 超纯水并混合，10 分钟后将供体鱼和含 CAS 的液体加入暴露水箱。
3. 行为测试：实验采用了多种行为测试方法。LDT 用于评估幼年斑马鱼的一般焦虑，在透明塑料培养皿中进行，根据鱼在黑色区域和边界区域的停留时间来判断焦虑程度。OFT 主要评估幼年斑马鱼的一般运动活动和新奇诱发的焦虑样行为，与 LDT 装置相似，但整个底部为透明。NTT 用于测量成年斑马鱼的运动、焦虑样行为和大胆程度，将鱼放入新颖水箱，根据其在顶部和底部区域的活动情况进行评估。nOFT 是一种新颖的测试方法，可同时评估成年斑马鱼的明暗偏好、开放场活动和对攻击者的风险行为反应，装置分为多个区域，通过观察鱼在不同区域的停留时间和行为来进行分析。
4. 统计分析：研究人员使用 GraphPad Prism? 8.0.1 软件进行统计分析。由于斑马鱼行为的差异性，采用 Kruskal - Wallis 检验来确定 CAS 浓度对其行为输出的影响，并使用 Dunn’s 程序进行事后成对比较。统计显著性设定为 p < 0.05，同时计算 Cohen’s d 效应大小来评估影响的程度。

实验结果：年龄差异导致的不同行为表现

1. 幼年斑马鱼行为：在 LDT 测试中，不同浓度 CAS 暴露下，幼年斑马鱼的总游动距离、冻结时间和在黑暗区域的停留时间差异均不显著，但在边界区域的停留时间存在显著差异。暴露于从单条鱼提取的 CAS 的幼年斑马鱼，在边界区域的停留时间显著少于非应激鱼。在 OFT 测试中，CAS 浓度对总移动距离、在边界区域的停留时间和冻结时间均无显著影响。
2. 成年斑马鱼行为：在 NTT 测试中，创伤与 CAS 暴露显著影响了成年斑马鱼的所有测试指标。与对照组相比，除 A1 组外，所有应激组的总游动距离均显著降低；A4 和 A8 组的冻结时间显著增加；A4 和 A8 组进入顶部区域的次数显著减少；A12 组在顶部区域的停留时间显著增加。在 nOFT 测试中，不同组之间在冻结时间和在黑暗区域的停留时间存在显著差异。A1 和 A8 组的冻结时间显著少于非应激鱼，A8 组在黑暗区域的停留时间也显著少于对照组。此外，斑马鱼在 NTT 和 nOFT 中的冻结行为存在明显差异，这表明在不同测试情境下，斑马鱼的行为反应不同。

讨论：深入剖析实验结果背后的机制

1. 幼年斑马鱼行为解读：幼年斑马鱼在经历创伤应激后，大多数行为指标与非应激鱼相比变化不大，这一结果令人意外。一种可能的解释是，在压力敏感的发育阶段，过度的创伤应激可能导致神经内分泌系统对压力的敏感性发生改变，可能表现为应激系统的过度激活或低激活。本实验结果更倾向于后者，即低激活导致行为适应不明显，仅在 LDT 测试中的趋触性指标上表现出显著差异。此外，幼年斑马鱼在非应激状态下对测试环境的反应也值得关注。它们在 LDT 和 OFT 测试中的行为可能受到自然的反捕食本能影响，对新奇和潜在危险环境表现出回避行为。而暴露于从单条鱼提取的 CAS 的幼年斑马鱼在 LDT 测试中趋触性降低，可能是一种应激诱导的适应行为，也可能表明 CAS 引发的生物学应激反应与肾上腺素能系统类似，导致其焦虑样行为减少或风险行为增加。不过，OFT 测试中未观察到类似变化，可能是由于测试顺序导致的习惯化效应。
2. 成年斑马鱼行为解读：成年斑马鱼在经历创伤和不同浓度 CAS 暴露后，表现出与对照组不同的焦虑样和风险行为。在 NTT 测试中，除 A1 组外，应激组的斑马鱼减少了对水箱的探索，增加了冻结行为，同时部分组在顶部区域的停留时间增加，这表明它们的焦虑样和风险行为增加。在 nOFT 测试中，虽然结果不如 NTT 测试清晰，但 A8 组的斑马鱼表现出减少的避光性和冻结反应。然而，斑马鱼在 NTT 和 nOFT 中的冻结行为存在显著差异，这可能与两个测试模拟的环境不同有关。NTT 模拟的环境相对更利于斑马鱼逃避捕食者，而 nOFT 模拟的环境更接近其自然栖息地，可能导致更高程度的冻结行为。因此，在不同测试中直接比较斑马鱼的冻结行为是不准确的。
3. 研究局限性：本研究虽然取得了一些有价值的成果，但也存在一定的局限性。研究未单独评估创伤或 CAS 浓度作为应激调节因素的作用，也未进行神经化学分析，如对皮质醇和去甲肾上腺素的检测，这将有助于深入了解行为变化的神经生理机制。此外，未对不同组的 CAS 进行量化和表征，无法确定实际浓度差异。未来研究需要解决这些问题，以更好地理解行为与生理过程之间的复杂关系。

结论：为未来研究指明方向

本研究表明，CAS 供体数量是斑马鱼压力研究中需要考虑的重要因素。幼年斑马鱼在暴露于与单条成年斑马鱼提取的 CAS 配对的创伤时，在 LDT 测试中表现出与焦虑相关的趋触行为减少；成年斑马鱼则显示出 CAS 暴露的供体数量依赖性效应，从八条斑马鱼提取的应激配对 CAS 似乎产生了最显著的焦虑样反应。然而，研究并未明确幼年斑马鱼对 CAS 的厌恶程度是否与成年斑马鱼相同，以及它们对创伤应激的整体弹性如何。本研究首次探讨了不同数量 CAS 供体与创伤应激配对对幼年和成年斑马鱼行为的影响，但仍需在神经生物学层面进一步研究，以明确这些结果的生理基础。在使用多种行为范式评估斑马鱼焦虑样行为时，必须考虑测试特定的自然行为，以便更好地解释实验结果。总之，本研究揭示了 CAS 在斑马鱼应激反应中的关键调节作用，为后续研究提供了重要的参考。