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为解决非模式革兰氏阴性菌遗传操作难题，研究人员用 I-SceI 核酸内切酶策略，成功创建插入和基因替换，助力细菌研究。
在生命科学的研究长河中，蛋白质研究至关重要。自 DNA 被确定为主要遗传物质后，遗传学蓬勃发展，人类基因组计划的成功更是让基因测序成本降低，大量遗传数据涌现，推动了对细菌生理和致病性的研究。在研究细胞对刺激的反应时，获取实时信息十分关键，尤其是在研究细菌对抗生素应激的反应方面。例如，研究发现抗生素除了作用于预期靶点，还会导致细菌蛋白重新定位到不同的亚细胞区室，这一信息对于在体外确定治疗方案的有效性意义重大，特别是在应对多药耐药（MDR）细菌时。
在研究蛋白定位和表达的过程中，荧光蛋白是常用的工具。然而，目前针对模式革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）的遗传操作方法虽多，但对于非模式细菌，传统的等位基因交换诱变通常仅用于创建缺失，在创建插入和基因替换方面的应用较少，相关操作繁琐且效果不佳。为了突破这一困境，来自根特大学（Ghent University）实验室微生物学（蛋白质研究组）的研究人员 Darshan Chandramowli 和 Bart Devreese 开展了深入研究，相关成果发表在《AMB Express》上。
研究人员采用了 I-SceI 核酸内切酶介导的等位基因交换策略。该策略的大致流程为：首先构建含有 “缺陷” 复制起点和目标位点同源区域的自杀质粒，将其导入目标细菌，使其通过同源重组（HR）整合到基因组中；之后再导入组成型表达 I-SceI 核酸内切酶的质粒，引发双链断裂（DSB），断裂由目标细菌的 HR 介导机制修复，从而实现突变的引入。这一策略具有诸多优势，如相对高效，对研究信息有限的细菌时，仅需基本的微生物学和分子技术知识；无需额外去除抗生素标记步骤，减少了自发突变的风险；自杀载体具有广泛适用性。
研究人员利用该策略，以多药耐药的嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）临床分离株（菌株 44/98，LMG 26824）为模型进行了一系列实验：
- 构建读码框内插入（atpG:egfp 和 smlt1054:egfp）：为展示该方法在创建位点特异性插入方面的实用性，研究人员选择在 ATP 合酶 γ 亚基 atpG 和噬菌体编码的内溶素 smlt1054 的读码框内插入增强型绿色荧光蛋白（eGFP）编码序列。在设计插入片段时，考虑了诸多因素，如终止密码子的位置、是否添加连接子以及基因所在的正负链等。构建好自杀质粒后，通过三亲交配导入嗜麦芽窄食单胞菌，再导入核酸内切酶质粒，经筛选和测序确认成功获得突变体。荧光显微镜观察发现，atpG:egfp 突变体的荧光出现在细胞边界，但该突变体生长略有受损；smlt1054:egfp 突变体在添加诺氟沙星诱导 DNA 应激后，部分细胞出现荧光，且这些细胞明显长于野生型细胞，激活了细菌 SOS 反应。
- 替换内源性等位基因（smlt0387 替换为 smlt0387:mCherry）：研究人员还展示了该方法用于靶向替换整个基因的能力。他们选择用 N 端标记 mCherry 的 Smlt0387:mCherry 替换外膜蛋白 Smlt0387。同样构建好替换等位基因的自杀质粒，转化后经筛选和测序确认成功获得突变体。荧光显微镜下可观察到 mCherry 荧光定位于细胞周边。
在研究过程中，研究人员还对一些关键环节进行了探讨：
- pGPI-SceI-XCm 自杀质粒及突变等位基因设计：pGPI-SceI-XCm 自杀质粒是在 pGPI-SceI 质粒基础上改进而来，其复制依赖于 Pir 蛋白，可在 E. coli pir+菌株中复制，在嗜麦芽窄食单胞菌中则需整合到基因组才能复制。设计突变等位基因时，要考虑同源序列长度对重组的影响，下游同源序列较长时更有利于获得所需突变。此外，构建自杀质粒较为繁琐，可选择外包合成和克隆，且需使用高保真聚合酶扩增，构建后测序验证。
- 转化方法 —— 三亲交配（结合）与电穿孔：针对嗜麦芽窄食单胞菌的转化，研究人员对比了三亲交配和电穿孔两种方法。对于转化 pGPI-SceI-XCm，三亲交配获得的接合子更多，假阳性更少；而转化 pDAI-SceI-SacB 时，电穿孔能更快获得可筛选的菌落，但筛选更耗费资源。研究人员建议用户可根据实际情况选择合适的转化方法。
- 筛选转化子：pGPI-SceI-XCm 上的 xylE 报告基因简化了转化子的筛选，转化自杀质粒后，可通过喷洒邻苯二酚筛选，变黄的菌落为成功的接合子，但该方法也存在一些弊端。转化 pDAI-SceI-SacB 后，可根据突变类型选择合适的引物进行 PCR 筛选。对于多药耐药菌，可通过测定最低抑菌浓度（MIC）来确定抗生素的筛选浓度。
与其他方法相比，此前虽有研究利用等位基因交换诱变和 I-SceI 核酸内切酶策略对革兰氏阴性菌进行遗传操作，但大多局限于特定菌株或仅用于基因删除，且未见在非模式菌株中进行位点特异性插入和基因替换的报道。本研究首次全面展示了利用该策略在非模式菌株中进行多种遗传操作的方法，创建了多种突变体，还为后续研究提供了常见问题和故障排除步骤指南。这一研究成果为深入了解和应用其他未充分研究的（高耐药）革兰氏阴性菌奠定了基础，有望推动相关领域的进一步发展。
