改造大肠杆菌 BL21 (DE3)：实现木糖优先利用的代谢与调控工程突破

研究人员为解决大肠杆菌木糖利用受碳分解代谢物阻遏（CCR）问题，构建木糖选择性菌株 ES04，其可优先利用木糖，揭示新 CCR 机制。

　　在微生物的 “糖世界” 里，木糖（Xylose）是自然界中储量丰富的一种五碳糖，就像隐藏在生物资源宝库中的一颗明珠。然而，它常常与葡萄糖（Glucose）混合存在，这一 “组合” 却给许多微生物带来了麻烦。在这个混合糖的环境中，微生物会出现碳分解代谢物阻遏（Carbon Catabolite Repression，CCR）现象，就好比微生物体内的代谢 “交通” 被堵塞了，木糖的利用效率大打折扣。

在大肠杆菌（Escherichia coli）的不同菌株中，代谢和调控方式存在着显著差异，这就像不同城市有着不同的交通规则一样。例如，菌株 BL21 (DE3) 在代谢葡萄糖时，有氧和无氧条件下的生长速度会有明显变化；而菌株 W 在这两种条件下的生长速度却较为稳定。这些差异使得开发针对不同大肠杆菌菌株的木糖选择性代谢工程策略变得至关重要。

为了攻克这些难题，来自墨西哥国立自治大学（Universidad Nacional Autónoma de México）的研究人员 Eliseo R. Molina?Vázquez、Luis Caspeta 等人开展了深入研究。他们的研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology 》上，为大肠杆菌木糖利用的研究开辟了新的道路。

研究人员运用了多种关键技术方法。在菌株构建方面，通过基因敲除技术，利用噬菌体 P1 转导系统和 lambda red 系统，对相关基因进行失活操作，构建出一系列木糖选择性菌株。在分析检测方面，采用分光光度法监测菌株生长，通过高压液相色谱（HPLC）测定葡萄糖和木糖含量，运用转录组学分析技术研究基因表达变化，还利用统计分析软件对实验数据进行处理和分析 。

下面来看看具体的研究结果：

1. 构建木糖选择性菌株：研究人员参考 K-12 和 C 菌株的代谢工程策略，对 BL21 (DE3) 进行改造，敲除 glk、manZ 和 ptsG 基因得到 ES02 菌株，再敲除 crr 基因得到 ES03 菌株。实验发现，ES02 和 ES03 菌株几乎不能利用葡萄糖，ES02 在利用木糖方面表现更优，因此被选择进行后续研究12。
2. XylR^Q31K对木糖利用的影响：在 ES02 菌株中分别表达非经典木糖转运体 GatC^{S184L R216C}和转录激活因子 XylR^Q31K。结果显示，GatC^{S184L R216C}对菌株利用木糖的能力没有显著提升，而 XylR^Q31K不仅显著提高了 ES02 在木糖培养基中的木糖消耗速率，还缓解了葡萄糖对木糖利用的抑制作用，使菌株在木糖 - 葡萄糖混合培养基中能更高效地利用木糖34。
3. XylR^Q31K的染色体整合：将编码 XylR^Q31K的基因 xylR^C91A整合到 ES02 染色体上，得到 ES04 菌株。ES04 在利用木糖时，最大生物量增加，且木糖消耗速率和生长速率与携带质粒表达 XylR^Q31K的 ES02 菌株相当，但生长性能更优56。
4. 葡萄糖消耗与半乳糖醇操纵子的关系：研究发现，ES04 菌株部分恢复了葡萄糖消耗能力，但消耗速度较慢，且在木糖存在时优先利用木糖。转录组学分析表明，ES04 在葡萄糖培养基中生长时，半乳糖醇操纵子 gatDCBAZY 显著上调。进一步敲除 gatC 基因和整个 gatDCBAZY 操纵子后发现，整个操纵子的缺失显著降低了 ES04 对葡萄糖的同化能力，说明该操纵子与 ES04 的葡萄糖消耗有关78。

综合研究结果和讨论部分，这项研究具有重要意义。首先，研究表明针对不同大肠杆菌菌株开发木糖选择性代谢工程策略时，需要充分考虑菌株的遗传背景差异。其次，XylR^Q31K的引入有效提升了木糖利用效率，同时揭示了一种新的碳分解代谢物阻遏调控机制，即菌株在木糖存在时优先利用木糖，木糖耗尽后才开始利用葡萄糖。此外，研究还发现半乳糖醇操纵子在 ES04 的葡萄糖同化过程中发挥了重要作用。这些发现为进一步优化大肠杆菌的糖代谢工程提供了理论依据和实践指导，有助于推动微生物发酵生产等相关领域的发展，让微生物更好地为人类服务，比如在生物燃料生产、生物基化学品合成等方面，有望提高生产效率和降低成本 。