丁酸梭菌（Clostridium butyricum）对黄酮类化合物的代谢能力

本文研究了丁酸梭菌代谢黄酮类化合物的能力，发现其在无葡萄糖时可代谢多种黄酮，且具有立体特异性。

　　### 丁酸梭菌（Clostridium butyricum）对黄酮类化合物的代谢能力

黄酮类化合物是植物合成的一类多酚，广泛存在于土壤和人类饮食中。研究发现，黄酮类化合物的摄入与多种慢性疾病的风险呈负相关，但其在人体内吸收和代谢较差，大部分进入大肠被肠道微生物群代谢。因此，明确微生物对黄酮类化合物转化的作用至关重要。

引言

黄酮类化合物（flavonoids）是植物合成的多酚，经凋落物分解进入土壤，也是人类食物和饮料的成分。研究表明，黄酮类化合物的摄入与多种慢性疾病风险呈负相关，这得益于其在实验研究中展现的多种生物学效应。然而，人体对大多数黄酮类化合物的吸收和代谢能力较弱，它们进入大肠后可被肠道微生物群代谢。由于黄酮类化合物的健康益处可能由其代谢产物介导，因此需要明确微生物对黄酮类化合物转化的贡献。大多数黄酮类化合物以糖苷形式存在，去糖基化是其转化的第一步。许多肠道细菌可进行黄酮类化合物的去糖基化，但后续苷元的转化在人类肠道微生物群中较为罕见。

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）存在于多种缺氧生态系统，包括哺乳动物肠道和土壤。它是人和动物肠道微生物群的常见细菌，部分菌株已被用于益生菌，目前在欧洲也被批准作为饲料添加剂和食品成分。早期研究发现，丁酸梭菌可降解柠檬果实中的黄酮类化合物圣草酚（eriodictyol），但该研究未深入跟进。已知少数能催化黄酮类化合物 C 环裂解的人类肠道细菌属于真杆菌科（Eubacteriaceae）、颤螺旋菌科（Oscillospiraceae）或毛螺菌科（Lachnospiraceae），若丁酸梭菌也具备此能力，将是首个能转化黄酮类化合物的人类肠道梭菌科物种。本研究旨在评估丁酸梭菌代谢多种黄酮类化合物的能力，并基于实验结果和文献数据，探究其基因组中参与黄酮类化合物转化的酶。

材料和方法

1. 化学试剂：研究中使用的多种黄酮类化合物，如芹菜素（apigenin）、芹菜素 - 7 - O - 葡萄糖苷（apigenin-7-O-glucoside）等，分别购自不同供应商。
2. 细菌菌株和培养：实验使用丁酸梭菌 DSM 10702^T，在严格厌氧条件下，于含特定气相的 Hungate 管中，以改良的强化梭菌培养基（RCM_mod）在 37°C 培养 14 小时。
3. 黄酮类化合物转化测试：分别使用含葡萄糖和不含葡萄糖的 RCM_mod培养基进行孵育实验。向培养基中添加黄酮类化合物储备液和丁酸梭菌过夜培养物，在厌氧工作站中孵育，定时取样。同时设置单独孵育的黄酮类化合物和细菌作为对照，实验重复进行。
4. HPLC 分析：采用反相高效液相色谱 - 二极管阵列检测（RP - HPLC/DAD）分析样品。使用不同的色谱柱和流动相条件，对黄酮类化合物及其代谢产物进行分离和鉴定。通过标准化合物的校准曲线进行定量分析。
5. 序列分析：运用基本局部比对搜索工具（BLAST）进行序列相似性搜索和比较。使用相关网络工具预测转录启动子、终止子序列，信号肽可能性以及蛋白质的亚细胞定位，并分析蛋白质序列的保守结构域。

结果

1. 丁酸梭菌对黄酮类化合物的转化：在含葡萄糖的 RCM_mod培养基中，丁酸梭菌对黄酮类化合物的去糖基化作用受抑制，如异槲皮苷（isoquercetin，即 quercetin-3-O-glucoside）在 144 小时内未转化，芹菜素 - 7 - O - 葡萄糖苷仅生成少量芹菜素。而在不含葡萄糖的培养基中，这些黄酮类化合物可快速转化。进一步研究发现，丁酸梭菌可将多种黄酮类化合物转化为相应产物，如异槲皮苷转化为槲皮素（quercetin），芹菜素 - 7 - O - 葡萄糖苷和芹菜素完全降解为 3 - (4 - 羟基苯基) 丙酸（4 - HPP），柚皮素（naringenin）和根皮素（phloretin）转化为 4 - HPP，圣草酚代谢为 3 - (3,4 - 二羟基苯基) 丙酸（3,4 - DPP）。但部分黄酮类化合物，如槲皮素、芦丁（astilbin）等，在 144 小时内未被代谢。
2. 丁酸梭菌对柚皮素、圣草酚和花旗松素的立体特异性转化：使用外消旋的柚皮素、圣草酚和花旗松素（taxifolin）进行孵育实验，发现丁酸梭菌对这些化合物的转化具有立体特异性。它仅转化 (2S)- 柚皮素和 (2S)- 圣草酚，对 (2R)- 对映体的转化速率较低。花旗松素则优先转化 (2R,3R)- 立体异构体。此外，葡萄糖的存在会影响丁酸梭菌对柚皮素的转化，在含葡萄糖培养基中，柚皮素的转化不完全。
3. 根皮素对丁酸梭菌生长的抑制作用：根皮素的裂解速度比柚皮素和芹菜素慢，这可能与根皮素的抗菌作用有关。实验监测发现，根皮素显著延迟了丁酸梭菌的生长，直至其被降解。
4. 丁酸梭菌基因组中潜在的黄酮类化合物转化酶：对丁酸梭菌基因组进行搜索，发现其编码多种潜在的黄酮类化合物转化酶，包括 β - 葡萄糖苷酶、黄酮还原酶（FLR）、黄酮醇 / 黄酮醇裂解还原酶（Fcr）和根皮素水解酶（Phy）。这些酶的氨基酸序列与已鉴定的功能酶有一定的相似性，但仍需进一步研究验证其功能。此外，编码 FLR、Fcr 和 Phy 的基因在基因组中呈操纵子样结构，推测它们在黄酮类化合物降解途径中发挥作用。

讨论

肠道细菌在膳食黄酮类化合物的代谢中起关键作用，影响着黄酮类化合物对人体健康的预防效果。本研究表明，丁酸梭菌能在无葡萄糖条件下去糖基化黄酮类葡萄糖苷，其去糖基化酶可能受葡萄糖抑制。丁酸梭菌还可裂解不同黄酮类化合物的苷元，是首个被证实能转化黄酮类化合物的人类肠道梭菌科成员。与其他能降解黄酮类化合物的肠道细菌相比，丁酸梭菌的酶对不同黄酮类化合物的作用存在差异。

通过基因组搜索发现的潜在黄酮类化合物代谢酶，虽然与已知功能酶有一定相似性，但仍需进一步功能验证。丁酸梭菌可能利用黄酮类化合物作为替代生长底物，并通过降解去除抑制生长的黄酮类化合物，如根皮素对其生长的抑制作用。

丁酸梭菌在哺乳动物肠道和土壤环境中都可能具有重要意义。随着其作为益生菌在人类和农场动物中的应用越来越广泛，进一步研究其黄酮类化合物转化活性，对于深入了解其健康促进作用和未来应用具有重要价值。