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研究人员开发 epi - TK 检测法评估化学物诱导的表观遗传效应，可检测双向变化，助力化学品安全评估。
在生命的微观世界里，化学物质如同神秘的 “魔法师”，它们对细胞的影响深远，尤其是在致癌过程中扮演着重要角色。许多化学物质可通过遗传、代谢等多种途径致癌，其中表观遗传改变是一个关键环节。DNA 甲基化和组蛋白修饰等表观遗传变化，参与了 X 染色体失活、基因组印记等重要过程，就像细胞内精密的 “开关”，调控着基因的表达。比如，DNA 甲基化由 DNA 甲基转移酶（DNMTs）催化，在维持基因组稳定中发挥着重要作用。而环境中的化学物质，如双酚 A、砷等，以及一些药物，都可能干扰这些 “开关”，引发异常的表观遗传变化，进而导致各种疾病。
目前，评估化学物质潜在风险的常规方法主要集中在遗传毒性检测，如细菌 Ames 试验、哺乳动物细胞染色体畸变试验等。然而，对于化学物质诱导的表观遗传效应，现有的检测方法存在诸多不足。虽然已经有一些基于细胞的报告基因检测方法，像利用绿色荧光蛋白（GFP）等作为报告基因来检测表观遗传修饰，但这些方法大多只能单向检测基因表达的变化，无法全面反映化学物质对细胞表观遗传的复杂影响。而且，目前对于管家基因在表观遗传检测中的作用了解甚少，这也限制了相关检测方法的发展。因此，开发一种简单、高效且能双向检测化学物质诱导的表观遗传效应的方法，成为了科学界亟待解决的问题。
为了攻克这一难题，来自日本千叶大学和日本国立卫生科学研究所的研究人员展开了深入研究。他们以胸苷激酶（TK）基因突变试验（TK assay）技术为基础，开发了一种名为 “epi - TK 检测法” 的新型表观遗传毒性检测方法，并将研究成果发表在《Scientific Reports》上。
研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。首先，利用 CRISPR/dCas9 - SunTag - DNMT3A 系统对人淋巴母细胞 TK6 细胞内源性 TK 基因的 CpG 启动子位点进行编辑，使其甲基化，从而构建出稳定的 mTK6 细胞系。接着，采用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT - qPCR）检测基因表达水平；通过亚硫酸氢盐测序（Bisulfite sequencing）分析 DNA 甲基化状态；运用染色质免疫沉淀 - 定量 PCR（ChIP - qPCR）和蛋白质免疫印迹（Western blotting）技术探究组蛋白修饰状态。
下面来看具体的研究结果：
- 建立评估化学诱导表观遗传改变的人 TK6 衍生细胞系：研究人员利用 CRISPR/dCas9 - SunTag - DNMT3A 和特定的 sgRNA 表达质粒，使内源性 TK 基因启动子区域的 CpG 位点甲基化，成功建立了 mTK6 细胞系。该细胞系在含三氟胸苷（TFT）的培养基中能稳定增殖，且其增殖时间与原代 TK6 细胞系相似。RT - qPCR 分析显示，mTK6 细胞中 TK 基因表达因启动子区域 DNA 甲基化而被抑制。同时，研究人员还观察到，在去除 TFT 后，TK 回复突变频率随时间增加，这表明在细胞分裂过程中，启动子区域的 CpG 位点会自发去甲基化。
- 定量共价和非共价 DNA 甲基转移酶抑制剂的表观遗传效应：研究人员用 5 - 氮杂 - 2′ - 脱氧胞苷（5 - azadC）和 GSK - 3484862 这两种典型的 DNA 去甲基化剂处理 mTK6 细胞。结果发现，5 - azadC 在最高浓度（0.1 μM）时，可使 TK 回复突变频率增加 230 倍；GSK - 3484862 也能显著提高 TK 回复突变频率，且呈剂量依赖性。亚硫酸氢盐测序分析表明，TK 启动子的 DNA 甲基化模式与其基因表达状态密切相关，在自发和 DNMT 抑制剂介导的 TK 回复突变菌落中，所有 CpG 位点均未甲基化。
- 确定甲基化 TK 基因启动子中的组蛋白修饰状态：转录活跃的染色质在靶基因转录起始位点附近存在 H3K27ac 和 H3K4me3。ChIP - qPCR 分析显示，mTK6 细胞中 K3K27Ac 和 H3K4me3 的富集水平与 TK6 细胞相当。用组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂伏立诺他（vorinostat）和曲古抑菌素 A（trichostatin A）处理 mTK6 细胞后，TK 回复突变频率并未受到显著影响，这可能是由于 mTK6 细胞中 TK 启动子区域存在抑制性 DNA 甲基化时，H3K27Ac 和 H3K4me3 水平持续存在。
- 检测非遗传毒性致癌物 / 炎症诱导剂 12 - O - 十四烷酰佛波醇 - 13 - 乙酸酯（TPA）的表观遗传后果：研究人员用 TPA 处理 mTK6 细胞，发现随着 TPA 浓度增加，细胞存活率约为 40 - 50%，同时 TK 回复突变频率显著降低，最大降幅达 28 倍。ChIP - qPCR 和 Western blotting 分析表明，TPA 处理导致 GAPDH 和 TK 基因座的 H3K27Ac 水平显著降低，但 H3K4me3 的富集没有明显变化。RNA - seq 分析显示，TPA 处理并未引起与表观遗传调控相关基因的差异表达，这表明 H3K27Ac 水平的降低并非由直接调节染色质状态的表观遗传因子表达变化所致。
研究结论和讨论部分指出，epi - TK 检测法基于标准的遗传毒性测试流程，操作简便、成本效益高，能够有效定量化学物质诱导的表观遗传变化，为评估化学物质的安全性提供了新的有力工具。通过该检测法，研究人员不仅能检测到 DNMT 抑制剂诱导的 TK 回复突变频率增加，还首次发现非遗传毒性致癌物 TPA 可使 TK 回复突变频率显著降低。此外，研究还揭示了 TPA 诱导的 H3K27Ac 水平降低可能与炎症相关，这为进一步研究 TPA 的致癌机制提供了新线索。然而，目前 TPA 介导的 H3K27Ac 降低的确切机制仍不明确，需要更多研究来深入探究。总体而言，这项研究成果为化学物质的表观遗传毒性评估开辟了新方向，对保障人类健康和环境安全具有重要意义。
