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为探究 Lon 蛋白酶底物调控的蛋白水解机制，研究人员解析 LarA 与 Lon 的 N 端结构域（NTD）的结合机制，为理解其激活机制提供依据。
在微观的细胞世界里，蛋白质就像一群勤劳的 “小工人”，维持着细胞的正常运转。然而，当细胞遭遇各种 “压力”，比如高温等，这些 “小工人” 就可能会 “生病”，出现折叠错误或者受损的情况。如果不及时清理这些 “生病” 的蛋白质，细胞就会陷入混乱，甚至生病。这时，Lon 蛋白酶（一种与多种细胞活动相关的 ATP 酶（AAA
+）蛋白水解机器）就像是细胞中的 “清洁卫士”，负责清除受损或错误折叠的蛋白质，维持细胞内蛋白质的平衡（蛋白质稳态，proteostasis）。但一直以来，科学家们对 Lon 蛋白酶如何被激活、怎样识别底物的分子机制还不太清楚。为了揭开这个谜团，来自中国台湾 “中央研究院” 生物化学研究所和台湾大学的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员运用了多种技术方法来开展研究。首先是蛋白纯化技术，他们将构建好的质粒转化到大肠杆菌中，诱导表达目的蛋白，再通过一系列的色谱柱纯化得到高纯度的蛋白；然后利用结晶技术，获得了 LarA 与 Lon 的 N 端结构域（NTD）的复合物晶体；接着借助 X 射线衍射技术收集数据，解析出复合物的晶体结构；同时还运用了突变分析、荧光偏振（FP）、尺寸排阻色谱耦合多角度光散射（SEC-MALS）等技术，探究关键氨基酸残基的作用以及蛋白之间的相互作用。
下面来看具体的研究结果。
- LarA 与 CcLon 的 NTD 结合：研究人员通过重组蛋白表达纯化，结合尺寸排阻色谱分析，发现热休克蛋白 LarA 能与新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）的 Lon（CcLon）特异性结合，且结合位点在 CcLon 的 NTD。进一步实验表明，NTD 对 LarA 发挥激活 CcLon 降解底物的功能至关重要，并且 LarA 与 NTD 在溶液中形成 1:1 的异源二聚体。
- LarA 与 NTD 结合的整体结构：解析得到的 LarA-NTD 复合物晶体结构显示，CcLon-NTD 由两个亚结构域通过一段十个氨基酸的连接子相连，LarA 包含三个短 α 螺旋和一个由四条 β 链与一个 α 螺旋组成的核心结构。LarA 的 C 端芳香族残基（His89）结合在 NTD 的 N 亚结构域的 loop b2-a1 区域，同时其倒数第二个残基 Val88 也与 NTD 有疏水相互作用。此外，还发现 NTD 的 C 端区域在晶体中有两种不同构象，且一个 NTD 结合的 LarA 分子能与另一个 NTD 分子的 C 端尾巴结合。
- NTD 和 LarA 中的氨基酸残基结合口袋：通过突变分析，研究人员验证了 NTD 和 LarA 中保守氨基酸残基结合口袋的功能意义。如 NTD 中 Arg29 突变后，CcLon 降解 LarA 和 SciP 的活性明显降低，且无法与 LarA 形成复合物；LarA 中 Leu 结合口袋突变后，刺激 SciP 降解的活性丧失。同时，SciP 的 C 端疏水残基突变也会影响其被降解的效率。
- NTD 的结合暴露 LarA 的疏水核心：FP 实验表明，NTD 与 LarA 结合后会引起 LarA 构象变化，暴露其疏水核心形成 Leu 结合口袋。通过比较 apo LarA 和 LarA-NTD 复合物的结构，以及有限蛋白水解实验，进一步验证了这一结论。
在讨论部分，研究人员指出，NTD 通过保守口袋结合底物 C 端疏水或芳香族残基，LarA 与 NTD 结合后暴露疏水核心形成 Leu 结合口袋，二者的疏水口袋具有不同的结合特性。他们还提出了 Lon 蛋白酶底物或降解标签（degron）刺激底物降解的工作模型，NTD 在其中起着关键的调节作用。此外，研究人员推测其他激活 Lon 蛋白酶的蛋白，如 HspQ，可能通过类似 LarA 的机制发挥作用，而 SmiA 的作用机制可能涉及类似的构象变化，不过还需要进一步的结构分析来证实。同时，研究还发现不同 Lon 蛋白的 NTD 具有功能保守性，暗示在大肠杆菌甚至真核细胞中可能存在尚未被发现的类似 LarA 的蛋白，它们或许能通过与 NTD 相互作用调节 Lon 的活性。
这项研究成果意义重大，它首次揭示了 LarA 激活 Lon 蛋白酶的结构基础，为理解 Lon 蛋白酶在细胞应对各种生理压力时如何精准调控蛋白水解提供了关键信息，有助于深入了解细胞内蛋白质质量控制的分子机制，也为后续开发针对相关细胞功能异常疾病的干预策略提供了理论依据。
