增强果糖基转移酶催化位点周围亲水性微环境可提升其催化能力

为提升果糖基转移酶（SucC）催化效率，研究人员增强其活性位点亲水性微环境，发现 C66S 突变可提高催化效率。

　　在生命的微观世界里，酶就像一个个勤劳且精准的 “小工匠”，在各种生物过程中发挥着至关重要的作用，它们参与生物体内的化学反应，就如同精密的机器一般，推动着生命活动的有序进行。不仅如此，酶在生物技术领域也是大显身手，从食品工业中制作美味的乳制品，到医药领域助力药物研发，再到环境修复中帮助清理污染物，酶的身影无处不在。然而，随着各个行业对酶的需求日益增长，如何让这些 “小工匠” 变得更加高效，成为了科研人员们关注的焦点。

酶的催化活性受到多种因素的影响，其中活性位点周围的微环境起着关键作用。就像一个工匠的工作效率会受到周围环境的影响一样，酶的活性也会因为其所处的 “微环境” 而发生变化。在众多影响因素中，亲水性和疏水性的平衡尤为重要。但是，目前增加活性位点亲水性对酶活性的影响还尚未有明确的报道。

在这样的背景下，德班理工大学（Durban University of Technology）的 Fanzhi Wang、Suren Singh 和 Kugen Permaul 等研究人员展开了深入研究。他们以黑曲霉（Aspergillus niger）的果糖基转移酶 SucC 为研究对象，旨在探究增强活性位点亲水性微环境对其催化效率的影响。该研究成果发表在《Biotechnology Letters》上，为酶工程领域带来了新的思路和方法。

研究人员为了开展这项研究，运用了多种关键技术方法。首先，通过生物信息学分析，预测 SucC 的结构，确定催化位点和保守序列。接着，利用定点突变技术构建 SucC 的突变体，并将突变体在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115 中表达。之后，运用酶活性测定、酶动力学分析以及高效液相色谱（HPLC）等技术，对突变体的催化性能进行表征 。

下面来看看具体的研究结果：

• 黑曲霉 SucC 的结构特征：研究人员对黑曲霉 SucC 的氨基酸序列进行分析，发现其催化位点由 D64、D194 和 E271 组成的催化三联体，这是 GH32 和 GH68 家族糖苷水解酶的典型特征。通过 SWISS - MODEL 建模，得到了 SucC 可靠的三维结构，该结构包含 N 端小结构域、β - 螺旋桨结构域、α - 螺旋连接区和 C 端 β - 三明治结构域，为后续研究奠定了基础。
• 通过生物信息学分析筛选 SucC 突变候选体：为了增强 SucC 催化区域的亲水性，同时尽量不改变活性位点的构象，研究人员对 SucC 催化三联体周围的微环境进行分析。经过层层筛选，最终选定 Cys - 66 进行饱和诱变分析。结果发现，将 Cys - 66 突变为 Ser（C66S）后，对蔗糖的亲和力显著提高，且该突变不会显著改变活性位点的构象，因此选择 C66S 突变体进行进一步研究。
• 蔗糖通道模拟：研究人员对 C66S 突变体和野生型 SucC 的蔗糖通道进行模拟，发现 C66S 突变体的底物通道和产物出口通道的构象结构没有明显变化，这表明 C66S 突变不会影响底物和产物的运输，进一步证实了该突变体的可行性。
• 突变体 C66S 的生化特性：对 C66S 突变体进行生化表征，发现其比活性比野生型 SucC 提高了 61.3%，这意味着在相同条件下，C66S 突变体能够更高效地催化反应。酶动力学参数显示，C66S 突变体对蔗糖的亲和力增加，催化效率（kcat/Km）提高了 1.4 倍，这表明 C66S 突变体在将蔗糖转化为低聚果糖（FOS）的过程中速度更快，能够更有效地催化反应。此外，C66S 突变体的最适反应温度和 pH 与野生型 SucC 相同，但热稳定性有所下降，在碱性环境中的稳定性增强，这为其在不同反应条件下的应用提供了参考。
• C66S 介导更高效的 FOS 生产：通过 HPLC 分析 C66S 突变体和野生型 SucC 催化 FOS 生产的过程，发现 C66S 突变体在反应初期的反应速率明显更快，消耗的蔗糖更多，生成的 FOS 也更多，说明其在 FOS 生产的早期阶段具有更高的生产力。虽然最终两种反应生成的 FOS 总量相似，但 C66S 突变体在生成 DP₃（如蔗果三糖）时表现更优，DP₃达到最大产量的时间比野生型 SucC 更快，且不改变 FOS 的糖谱，这表明 C66S 突变体在 FOS 生产中具有竞争优势。

研究结论和讨论部分指出，本研究成功构建了 C66S 突变体，该突变体增强了活性位点周围的亲水性，提高了底物亲和力和催化效率，且在 FOS 生产中表现出色，尤其是在反应早期。这一研究成果表明，修饰酶活性位点的亲水性微环境是提高酶催化性能的有效策略，为未来酶工程的发展提供了新的方向。通过这种方法，可以优化更多的生物催化剂，使其在工业生产中发挥更大的作用，降低生产成本，提高生产效率，为相关行业的发展带来新的机遇。