长期滥用甲基苯丙胺致小鼠嗅觉障碍机制新发现：Notch1 信号通路与自噬的关键作用

研究人员为探究甲基苯丙胺（Meth）致嗅觉障碍机制，研究嗅球神经发生，发现其经自噬异常和 Notch1 信号影响，为治疗提供靶点。

　　在神经科学的神秘领域中，毒品对大脑的影响一直是科学家们重点研究的课题。甲基苯丙胺（Methamphetamine，Meth）作为一种强力的中枢神经系统兴奋剂，不仅具有高度成瘾性，还会对大脑造成严重的神经毒性。长期滥用 Meth 会导致认知、记忆等多种大脑功能受损，而其中嗅觉功能障碍这一后果却常常被忽视。在现实生活中，慢性 Meth 滥用者经常出现嗅觉异常，如嗅觉减退、幻嗅等症状，这不仅严重影响了他们的生活质量，还可能预示着大脑更深层次的损伤。然而，目前对于 Meth 诱导嗅觉功能障碍的潜在机制，科学界还知之甚少。为了揭开这一神秘面纱，南方医科大学、华南理工大学和贵州医科大学的研究人员开展了一项深入研究，相关成果发表在《Cell Biology and Toxicology》上。

研究人员为了探究 Meth 诱导嗅觉功能障碍的机制，进行了一系列实验。他们主要运用了行为学实验、免疫荧光、Western blot（WB）分析、细胞培养与分化分析等技术方法。通过对小鼠进行行为学实验，评估其嗅觉功能；利用免疫荧光和 WB 分析检测相关蛋白的表达和定位；通过细胞培养与分化分析研究神经干细胞（NSCs）的增殖和分化情况。

研究结果如下：

1. 慢性 Meth 给药诱导小鼠嗅觉缺陷：研究人员通过给小鼠腹腔注射 Meth（5mg/kg）持续四周，随后进行一系列行为学测试。在嗅觉阈值测试中，发现 Meth 降低了小鼠对厌恶气味（如丁醛）和喜爱气味（如柠檬烯）的嗅觉敏感性，需要更高浓度的气味才能使小鼠表现出厌恶或偏好行为。在嗅觉辨别测试中，慢性 Meth 处理的小鼠在面对新气味时，嗅探时间没有显著变化，表明其嗅觉辨别能力受损。在社会气味辨别测试中，这些小鼠对其他小鼠的陌生气味探索兴趣降低。在埋藏食物测试中，Meth 处理的小鼠找到埋藏食物的时间明显延长。这些结果表明，慢性 Meth 暴露显著损害了小鼠的嗅觉行为。
2. 慢性 Meth 给药诱导小鼠嗅球（OB）神经发生异常：研究人员首先探究 Meth 是否会导致脑室下区（SVZ）细胞死亡，TUNEL 染色结果显示 Meth 并未增加 SVZ 中凋亡细胞的数量。随后，他们分离培养成年小鼠 SVZ NSCs，用不同浓度 Meth 处理。结果发现，浓度高于 250μM 的 Meth 会显著诱导 NSCs 凋亡，因此在后续体外实验中选择 100μM 的 Meth。体外实验表明，Meth 显著降低了 NSCs 的 EdU 掺入率，减小了 NSCs 球的直径，同时降低了 Tuj1⁺细胞（神经元标记）的比例，增加了 GFAP⁺细胞（星形胶质细胞标记）的比例。体内实验也得到了类似结果，Meth 减少了增殖的 NSCs（BrdU⁺Sox2⁺细胞）数量，增加了星形胶质细胞的成熟数量，减少了新生神经元（BrdU⁺NeuN⁺细胞）的数量。这些结果表明，慢性 Meth 滥用导致小鼠 OB 神经发生异常，这可能是 Meth 使用相关嗅觉功能障碍的原因。
3. Meth 通过上调 Notch1 通路损害 NSCs 增殖和分化：Notch1 信号通路已被证明可驱动 NSCs 向星形胶质细胞命运分化。研究人员发现，慢性 Meth 处理的小鼠 SVZ 中 Notch1 及其下游靶点 NICD 和 Hes1 的表达显著升高，体外实验也表明 Meth 激活了 Notch1 信号通路。为了验证 Notch1 通路在 Meth 影响 NSCs 中的作用，研究人员使用 siRNA 沉默 NSCs 中 Notch1 的表达，并使用 Notch1 信号抑制剂 DAPT 进行处理。结果发现，沉默 Notch1 或抑制其信号通路可增加 Tuj1⁺和 EdU⁺细胞的比例，减少 GFAP⁺细胞的比例，表明 Meth 通过上调 Notch1 信号通路破坏了 NSCs 的正常生物学活动。
4. 抑制 Notch1 信号通路可恢复受损的神经发生并改善嗅觉功能障碍：基于体外实验结果，研究人员在体内进一步研究抑制 Notch1 通路的作用。在 Meth 给药的前六天，给小鼠腹腔注射 DAPT 阻断 Notch1 信号。结果显示，DAPT 减轻了慢性 Meth 小鼠中 Notch1 信号通路的过度激活，几乎将增殖的 NSCs 数量恢复到正常水平，增加了分化为神经元的细胞比例，减少了分化为星形胶质细胞的细胞比例，同时增加了新生神经元的数量。嗅觉行为测试表明，Meth + DAPT 组小鼠在嗅觉敏感性、嗅觉辨别能力、社会气味辨别能力和嗅觉依赖的食物探索能力等方面均有显著恢复。这表明 Notch1 是连接 Meth 诱导的嗅觉神经发生损伤与嗅觉功能障碍的关键分子。
5. Meth 通过下调 Stx17 抑制 Notch1 的自噬降解：由于 Notch1 受体及其裂解形式 NICD 是自噬降解的靶点，研究人员聚焦于自噬。实验发现，Meth 处理后，NSCs 中 Notch1 与 LC3 的表达和共定位显著增加，同时增加了 LC3、P62 和 Beclin - 1 的蛋白表达水平，表明自噬体 - 溶酶体融合受到破坏。通过使用 mRFP - GFP - LC3 评估自噬活性，发现 Meth 增加了 GFP⁺RFP⁺自噬体的数量，减少了 GFP^-RFP⁺自噬溶酶体的数量，进一步证实了自噬体与溶酶体融合受损。研究人员还发现，Meth 下调了 Stx17 的 mRNA 和蛋白表达水平，而过表达 Stx17 可逆转 Meth 诱导的自噬溶酶体融合损伤，增加 Notch1 在自噬溶酶体中的定位。这表明 Meth 通过下调 Stx17 损害自噬通量，过表达 Stx17 可挽救自噬并恢复正常的 Notch1 降解。
6. 过表达 Stx17 可挽救受损的神经发生并恢复小鼠的嗅觉功能：研究人员进一步研究恢复 Stx17 表达的作用。体外实验表明，在增殖状态下，Meth + Stx17 组的 EdU⁺细胞率高于 Meth 组；在分化状态下，Meth + Stx17 组神经元的比例增加，逆转了 Meth 诱导的向星形胶质细胞分化的趋势。体内实验中，将过表达 Stx17 的 rAAV 注射到 SVZ 后，发现过表达 Stx17 可部分减轻 LC3 和 P62 的上调，显著减弱 SVZ 中 Notch1 信号通路的激活，挽救受损的神经发生，减轻 Meth 诱导的小鼠嗅觉缺陷。

研究结论和讨论部分指出，该研究表明慢性 Meth 滥用可通过损害 OB 神经发生导致小鼠嗅觉功能障碍。Meth 降低了 SVZ NSCs 的增殖能力，使其分化偏好从神经元转向星形胶质细胞，这与 Meth 破坏自噬体 - 溶酶体融合有关，进而导致 Notch1 信号异常激活，最终改变了 NSCs 的命运决定。该研究为 Meth 诱导的神经毒性和感觉损伤提供了新的见解，揭示了自噬和 Notch1 信号通路在这一过程中的关键作用，为开发减轻 Meth 诱导的神经毒性和感觉损伤的治疗方法提供了潜在靶点。同时，研究也存在一些局限性，如未探索不同 Meth 剂量对 OB 神经发生的影响，以及未全面检查所有自噬相关基因等，为后续研究指明了方向。