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研究人员构建 SOX9 单倍体不足（HI）的人诱导多能干细胞（hiPSC）模型，揭示 SOX9 与 Noggin 的相互作用，为 Campomelic Dysplasia（CD）治疗提供新靶点。
在生命的奇妙旅程中，骨骼发育是至关重要的一环，而这其中，SOX9 基因扮演着不可或缺的角色。SOX9 是一种转录因子，在软骨形成和男性性腺发育等过程中发挥着关键作用。然而，一种名为 Campomelic Dysplasia（CD）的罕见先天性疾病，却给无数患者带来了痛苦。CD 由 SOX9 基因的单倍体不足（HI）引起，患者不仅会出现骨骼畸形，如马蹄内翻足、长骨弯曲等，还有 75% 的患者会出现性反转现象。而且，由于呼吸衰竭，多数 CD 患者在出生后不久便离世，其发病率约为 1/40,000 - 1/80,000。
以往，虽然对 SOX9 基因的功能有了一定了解，但由于缺乏合适的人类细胞模型，对于 SOX9 HI 的影响研究一直受阻。为了攻克这些难题，来自香港中文大学等机构的研究人员开展了深入研究。他们的研究成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》上，为我们揭开了 SOX9 基因在软骨形成过程中的神秘面纱，也为 CD 的治疗带来了新的希望。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先，利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，以健康男性供体的成纤维细胞诱导生成的人诱导多能干细胞（hiPSC）为基础，复制了 CD 患者中 SOX9 基因内含子 2 剪接位点的致病单点突变，构建了 SOX9 HI 模型。然后，通过转录组分析、染色质免疫沉淀 - 定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR）等技术，深入探究相关分子机制。同时，构建拯救模型，观察过表达 SOX9 对 HI 突变软骨细胞的影响。
研究结果如下：
- CRISPR/Cas9 介导的 SOX9 HI hiPSC 模型的建立：研究人员在实验室已有的 hiPSC 细胞系 iBC1.2 中，通过电穿孔导入 CRISPR/Cas9 组件，包括 sgRNA、BE3 和 GFP 质粒，成功在 hiPSC 中引入了 SOX9 基因内含子 2 剪接位点的 G > A 单点突变。经筛选和测序，获得了代表杂合（HT）和纯合（HM）单点突变的两个克隆，为后续研究 SOX9 基因剂量对发育的影响奠定了基础。
- hiPSC 来源的软骨细胞特征显示 SOX9 HI 突变体中软骨细胞标记物减弱：将 WT、HT 和 HM 三种基因型的 hiPSC 诱导分化为软骨细胞，在分化过程中，不同基因型的 SOX9 表达存在显著差异。在分化第 14 天，HT 和 HM 软骨细胞中，软骨细胞标记物 COL2A1 和 COL10A1 表达显著下降，软骨细胞积累硫酸化糖胺聚糖（GAGs）的能力也减弱，这表明 SOX9 基因剂量的减少会影响软骨细胞的功能。
- HT 软骨细胞无无义介导的衰减反应证据：由于模型中 SOX9 基因在 2 号外显子和 3 号外显子之间的剪接位点存在点突变，研究人员检测了无义介导的衰减（NMD）通路。结果显示，HT 和 HM 软骨细胞均表达 SOX9 mRNA，且 HT 软骨细胞中 NMD 相关基因无显著变化，说明该突变的 SOX9 mRNA 未触发 NMD 通路。
- SOX9 HI hiPSC 来源的软骨细胞的转录组分析：对 HT 软骨细胞进行转录组分析发现，约 400 个基因差异表达。基因本体（GO）分析表明，与模式规范和 BMP-SMAD 信号通路相关的生物过程富集；基因集富集分析（GSEA）显示，核糖体、染色体分离和细胞外基质（ECM）相关过程也受到影响。进一步研究发现，BMP 通路中的相关基因表达下调，而 BMP 通路抑制剂 Noggin 表达上调，且 SOX9 可与 Noggin 调控区域结合，这表明 SOX9 在 BMP 信号通路中可能通过调节 Noggin 表达发挥反馈作用。
- 通过过表达 SOX9 拯救 SOX9 HT 突变体：在软骨细胞分化第 9 天，用携带 SOX9 基因的慢病毒感染 HT 突变体，并添加强力霉素（dox）诱导 SOX9 表达。结果显示，过表达 SOX9 后，COL2A1 表达增加，细胞积累 GAGs 的能力也得到改善，这表明过表达 SOX9 可以有效挽救 SOX9 HI 突变体的生化表型。
研究结论和讨论部分指出，该研究首次建立了基于健康供体 hiPSC 的 SOX9 HI 模型，证明了 CD 患者中 SOX9 的单点剪接突变可导致 hiPSC 来源的软骨细胞发育缺陷，这进一步证实了 SOX9 单倍体不足与 CD 患者骨骼畸形之间的因果关系。同时，研究发现 BMP、SOX9 和 Noggin 之间存在反馈回路，SOX9 并非仅仅是 BMP 信号通路的下游基因。此外，过表达 SOX9 可有效恢复 COL2A1 表达和 GAGs 积累能力，强调了 SOX9 基因剂量的重要性。该研究不仅有助于深入理解 SOX9 基因剂量在发育过程中的意义，还可能为 CD 及其他软骨细胞异常疾病的治疗提供新的思路，如开发 Noggin 抑制剂进行局部给药等。
