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为探究 Vibrio splendidus AJ01 逃避吞噬体的机制，研究人员鉴定出 Sppsk1，其可抑制吞噬体酸化和成熟助细菌逃逸。
在微观的生物世界里，病原菌与宿主细胞之间无时无刻不在进行着一场看不见硝烟的战争。当病原菌入侵宿主细胞后，它们会被包裹在一种名为吞噬体（phagosome）的膜状结构中。吞噬体就像细胞的 “武器库”，会逐渐成熟并与溶酶体融合，形成吞噬溶酶体，从而将病原菌分解、消灭。然而，狡猾的病原菌为了生存和繁衍，进化出了各种巧妙的策略来逃避这一命运。
目前，虽然在一些高等脊椎动物的病原菌中，已经发现了多种逃避吞噬体降解的机制，但对于水生无脊椎动物病原菌的吞噬体逃避机制，人们了解得还非常有限。Vibrio splendidus AJ01 是一种能感染海洋养殖生物，尤其是海参的兼性细胞内细菌，对海参养殖业造成了严重的威胁。此前，研究人员虽发现了 AJ01 中的真核因子 STPKLRR 可促进其内化，但 AJ01 如何从吞噬体中逃脱，仍然是一个未解之谜。
为了揭开这个谜团，宁波大学的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》上，为理解病原菌与宿主的相互作用提供了新的视角。
研究人员运用了多种关键技术方法来开展这项研究。在筛选潜在真核样因子时，通过搜索 AJ01 基因组中相关激酶和磷酸酶，并绘制基因簇来寻找目标因子。构建 Sppsk1 突变菌株时，采用基于 sacB 的等位基因交换技术。利用免疫荧光（immunofluorescence）、全细胞 ELISA（Whole Cell ELISA）、蛋白质印迹（Western blot analysis）等技术来检测蛋白的定位、表达及相互作用；借助细菌腺苷酸环化酶双杂交系统（BACTH）验证蛋白间的相互作用；还运用了蛋白质 - 脂质结合测定（protein-lipid binding assay）、微量热泳动（MST）测定等方法探究蛋白与脂质的相互作用。
研究结果如下：
- Sppsk1 的鉴定与特征：通过分析 AJ01 的全基因组，研究人员发现了 19 个编码具有真核样丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶及磷酸酶的基因。进一步研究发现，Sppsk1 含有丝氨酸 / 苏氨酸 / 酪氨酸激酶（STYKc）结构域、蛋白磷酸酶 2C（PP2C）结构域和跨膜区域（TM）。免疫荧光显微镜观察和全细胞 ELISA 检测表明，Sppsk1 定位于细菌膜上，并通过细菌囊泡分泌。
- Sppsk1 与毒力及细胞内生存的关系：对比 AJ01 和 ΔSppsk1 的生长曲线和运动能力，发现两者生长曲线无显著差异，但 ΔSppsk1 的游泳能力减弱。感染实验表明，Sppsk1 的表达可被体腔细胞诱导，且缺失 Sppsk1 后，海参的存活率显著提高，体内细菌数量明显减少，这说明 Sppsk1 是 AJ01 感染所必需的毒力因子。
- Sppsk1 与吞噬体逃逸和成熟的关系：免疫荧光和透射电镜（TEM）分析显示，ΔSppsk1 与溶酶体共定位的比例增加，表明 Sppsk1 与吞噬体逃逸和成熟密切相关。进一步研究发现，Sppsk1 可抑制吞噬体成熟相关标记蛋白 EEA1、Rab7 和 Lamp1 的表达。
- Sppsk1 抑制吞噬体酸化的机制：研究表明，AJ01 可能通过抑制吞噬体酸化来在吞噬体内生存，而 Sppsk1 在其中起到了关键作用。删除 Sppsk1 会降低 AJ01 在酸性环境中的生存能力。通过细胞内 pH 检测实验发现，Sppsk1 可抑制吞噬体酸化，促进 AJ01 在吞噬体内的生存。
- STYKc 结构域的作用机制：利用 GST pull-down 技术筛选出 Sppsk1 的潜在结合蛋白，发现其与 V 型质子 ATP 酶亚基 ATP6V1C 相互作用。细菌腺苷酸环化酶双杂交系统和蛋白质对接分析进一步证实，Sppsk1 的 STYKc 结构域与 ATP6V1C 结合，并磷酸化其 S356 位点，从而抑制吞噬体酸化。
- PP2C 结构域的作用机制：蛋白质 - 脂质结合测定表明，Sppsk1 的 PP2C 结构域与 PtdIns (3) P 具有特异性亲和力。通过分子对接、突变实验和免疫荧光等方法，证实 PP2C 结构域可将 PtdIns (3) P 转化为 PtdIns，阻碍早期内体抗原 1（EEA1）的招募，进而抑制吞噬体成熟。
研究结论和讨论部分指出，Sppsk1 是一种新型的效应蛋白，具有独特的双功能。其 STYKc 结构域可磷酸化 ATP6V1C 的 S356 位点，抑制吞噬体酸化；PP2C 结构域可将 PtdIns (3) P 转化为 PtdIns，阻碍 EEA1 的招募，抑制吞噬体成熟。这种双功能特性在病原菌逃避宿主免疫的过程中发挥了重要作用，为研究病原菌的免疫逃避机制提供了新的靶点，也为相关疾病的预防和控制提供了理论依据。同时，该研究还发现真核样因子 Sppsk1 的结构与真核激酶相似，这为理解病原菌如何模拟真核生物功能逃避宿主免疫提供了线索。
总的来说，这项研究深入揭示了 Vibrio splendidus AJ01 逃避吞噬体的分子机制，为后续研究病原菌与宿主的相互作用奠定了坚实的基础，也为开发针对水生动物病原菌感染的防控策略提供了新的思路和方向。
