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本文利用单细胞 RNA 测序技术，揭示苔藓分生组织基因表达谱，发现细胞分裂素 - ESR 模块在维持干细胞特性中的重要作用。
研究背景
植物在 5 亿年前的陆地化进程是生物进化和全球环境演变的关键节点。在此期间，陆地植物发展出适应陆地环境的复杂三维结构，顶端分生组织的出现尤为重要。它包含多能干细胞，能不断产生可分化为各种细胞类型的细胞群体，是植物生长发育的关键。其中，茎尖分生组织（Shoot Apical Meristem，SAM）是整个地上部分的来源。
苔藓植物和维管植物是姐妹群，苔藓植物的 SAM 存在于配子体中，而维管植物的 SAM 形成于孢子体。由于绿藻缺乏多细胞孢子体，推测 SAM 最早在配子体中进化，随后才出现在孢子体中。因此，研究苔藓植物的 SAM 有助于揭示配子体和孢子体 SAM 中干细胞特化的基本分子机制，以及植物干细胞系统的起源和多样化。
此外，苔藓植物的 SAM 由单个干细胞（顶端细胞）组成，这意味着细胞命运的决定在单细胞水平上进行调控，阐明顶端细胞多能性的最小调控机制具有重要意义。此前的反向遗传学研究和转录组学分析已经揭示了苔藓植物干细胞系统的一些分子基础，但苔藓植物 SAM 的单细胞分辨率转录组仍未可知。本研究利用单细胞 RNA 测序（RNA-seq）技术对小立碗藓（Physcomitrium patens）进行研究，旨在确定调控多能干细胞的机制及其起源。
实验方法
- 构建小立碗藓配子体组织的单核转录组图谱：收集含有不同生长阶段的原丝体和叶状枝的小立碗藓植物组织，分离细胞核后进行标准的单核 RNA 测序（snRNA-seq）实验。通过均匀流形近似和投影（UMAP）及 Leiden 聚类分析，可视化转录组的异质性和同质性，以确定不同的细胞簇。利用已知的转录组数据寻找组织特异性表达模式的基因作为候选标记，构建启动子报告系，并进行批量 RNA 测序分析，以确定不同细胞簇对应的细胞类型。
- 分析 SAM 发育过程中的基因表达动态变化：聚焦于配子体细胞簇内的细胞，通过标记基因的表达确定未分化的分生组织细胞、分化为叶原基和茎 / 假根的细胞在 UMAP 图中的位置。利用轨迹检测推断细胞命运转变，对从原丝体到配子体轨迹周围的细胞进行伪时间分析，以研究细胞命运转变过程中基因表达的变化。
- 研究与生长素和形态发生相关的基因在分生组织发育中的表达：比较多能配子体顶端细胞和分化的分生组织细胞，研究分生组织发育过程中激活的基因类型。通过分析伪时间过程中基因表达的变化，确定生长素生物合成、信号传导和运输相关基因的表达模式。对配子体细胞进行分类，分别研究叶状枝和茎 / 假根组织轨迹中的基因表达变化。
- 探究细胞分裂素生物合成和感知的定位：在伪时间过程中显著变化的基因中，鉴定参与细胞分裂素生物合成和感知的基因。通过启动子活性分析，验证细胞分裂素生物合成基因在配子体顶端细胞的定位。
- 验证细胞分裂素 - ESR 模块对配子体顶端细胞形成的促进作用：筛选在配子体顶端细胞中显著上调的转录因子，确定关键调控基因。通过批量 RNA 测序分析，鉴定细胞分裂素响应基因。利用 CRISPR-Cas9 技术构建基因敲除突变体，研究基因功能。通过 β- 雌二醇诱导系统过表达基因，验证其对配子体顶端细胞形成的作用。
实验结果
- 小立碗藓配子体组织单核转录组图谱的构建：通过 snRNA-seq 实验，从三个独立重复中捕获了 21,832 个细胞，平均每个细胞捕获 1,005 个基因。经过质量筛选，14,454 个细胞用于详细分析。UMAP 和 Leiden 聚类分析显示存在五个不同的细胞簇，分别对应原丝体细胞、配子体细胞、过渡细胞和腋毛细胞。通过标记基因和批量 RNA 测序分析，验证了细胞簇的分类。对每个细胞簇的转录组特征分析发现，不同细胞簇具有特定的基因表达模式和生物学功能富集。
- SAM 发育过程中的基因表达动态变化：确定了一个分生组织标记基因，其在配子体顶端细胞第一次斜向分裂后清晰表达，且在高度分裂的组织中持续表达，但在完全展开的叶状枝中不表达。通过分析其他标记基因的表达，确定了未分化的分生组织细胞、分化为叶原基和茎 / 假根的细胞在配子体细胞簇中的位置。推断的细胞命运轨迹反映了 SAM 已知的发育模式，伪时间分析将细胞分为六个亚簇，并鉴定出 5,785 个在伪时间过程中表达显著变化的基因，这些基因被分为十个基因簇，每个基因簇在特定的发育阶段上调，与不同的生物学功能相关。
- 生长素和形态发生相关基因在分生组织发育中的表达：发现与生长素相关的基因在分生组织发育早期（GC5 基因）被激活，且在配子体顶端细胞中生长素响应较低，随着分生组织发育逐渐增加。在叶状枝和茎 / 假根组织轨迹中，分别有特定的基因簇（gGC2 和 gGC3）上调，与叶绿体成熟、细胞壁生物合成和顶端细胞形成的调控相关。
- 细胞分裂素生物合成和感知的定位：细胞分裂素受体基因在整个配子体细胞簇中上调，而细胞分裂素生物合成基因（PpLOG1–PpLOG3）在配子体顶端细胞位置特异性上调。PpLOG2启动子活性分析进一步证实了其在配子体顶端细胞的强定位。此外，在配子体顶端细胞位置还检测到两个细胞分裂素氧化酶基因的上调，表明细胞分裂素水平在该部位受到严格调控。
- 细胞分裂素 - ESR 模块对配子体顶端细胞形成的促进作用：在配子体顶端细胞中显著上调的转录因子中，发现ESR1（ENHANCER OF SHOOT REGENERATION 1）的同源基因（PpESR1–PpESR4）在细胞分裂素处理后显著上调。系统发育分析表明ESR基因在陆地植物中高度保守。通过构建敲除突变体发现，PpESR1–PpESR4促进配子体顶端细胞的形成，而PpESR5–PpESR9参与原丝体生长，与配子体顶端细胞发育无关。外源性应用细胞分裂素（BAP）处理野生型和突变体，进一步证实了PpESR1–PpESR4作为细胞分裂素下游调节因子促进配子体顶端细胞形成的作用。过表达PpESR1能诱导原丝体顶端细胞发生类似配子体起始阶段的变化，支持了其在促进多能配子体顶端细胞特性中的功能。
研究结论
本研究利用单细胞 RNA 测序技术，成功构建了小立碗藓配子体组织的单核转录组图谱，揭示了不同细胞类型的基因表达特征和细胞命运转变过程中的基因表达动态变化。发现细胞分裂素生物合成特异性地激活在苔藓分生组织的干细胞中，且细胞分裂素 - ESR 模块是促进陆地植物干细胞特性的保守机制，可能起源于陆地植物的共同祖先。然而，本研究也存在一定的局限性，如过表达PpESR1诱导的芽状结构未能发育成具有叶状枝的配子体，且部分细胞类型在本研究的单细胞数据中未被鉴定。未来需要进一步研究以探索完整配子体发育所需的条件，并对成熟配子体进行单细胞 RNA 测序，以完善对苔藓植物发育机制的理解。
