编辑推荐：
本文通过对小鼠的研究，揭示了 FOXP1 在新皮质发育中的重要作用及相关机制，为理解神经发育障碍提供依据。
### 引言
新皮质呈放射状分层结构，其兴奋性谷氨酸能神经元由位于脑室周围的生发区的祖细胞依次产生，深层神经元先产生，随后是上层神经元。新皮质发育过程精细复杂，任何偏差都可能增加神经发育障碍（NDDs）的易感性。叉头框蛋白 P1（FOXP1）综合征是由 FOXP1 基因突变或缺失引起的，FOXP1 作为转录因子，在皮质发育等多种过程中至关重要。患有 FOXP1 综合征的个体常表现出一系列神经和行为症状，包括智力障碍（ID）、语言障碍、运动发育迟缓以及自闭症谱系障碍（ASD）等。
此前的小鼠模型研究虽已展现出与 FOXP1 综合征相关的表型，但 FOXP1 在新皮质发育过程中，细胞类型特异性的分子机制仍不明确。在本研究中，研究人员旨在通过细胞类型特异性的方式，描绘 FOXP1 在新皮质发育中的分子作用，探究其基因调控网络以及对细胞命运决定和迁移的影响。
结果
- 单细胞 RNA 测序（snRNA - seq）和单细胞染色质可及性测序（snATAC - seq）鉴定差异表达基因（DEGs）和差异可及区域（DARs）：研究人员通过杂交获得 Foxp1 条件性敲除（Foxp1 cKO）小鼠和对照小鼠，选取胚胎期 13.5 天（E13.5）、16.5 天（E16.5）和出生后 0.5 天（P0.5）三个时间点，对整个皮质进行 snRNA - seq 和 snATAC - seq 分析。
在分析基因表达差异时发现，在胚胎期，Foxp1 缺失导致所有细胞类型中上调的 DEGs 数量显著增加，这与 FOXP1 作为转录抑制因子的作用相符；而在 P0.5 时，L5 - L6 和 L2 - L4 神经元中下调的 DEGs 更多，暗示 FOXP1 在出生后的作用可能发生转变。在染色质可及性方面，E13.5 和 P0.5 时更多的 DARs 处于关闭状态，这表明 Foxp1 缺失会导致染色质可及性发生变化，且这种变化与基因表达改变可能存在关联。
DEGs 与神经发育障碍 / 自闭症谱系障碍相关：为验证与 ASD 相关的 DEGs，研究人员采用单分子荧光原位杂交（smFISH）技术，对 Rora、Nrxn3 和 Kirrel3 这三个基因进行验证。Rora 是核类固醇激素受体和转录激活剂，在 ASD 患者中其蛋白水平降低且存在甲基化特异性沉默；Nrxn3 编码的蛋白在突触形成和功能中起关键作用，其变体与 ASD 相关；Kirrel3 编码细胞黏附分子，其变体在 ASD 患者和 ID/NDDs 个体中被发现，且 Kirrel3 敲除小鼠表现出与 ASD/ID 相关的表型。通过 smFISH 技术，研究人员证实了这些基因在 Foxp1 cKO 小鼠中的表达变化，进一步凸显了 FOXP1 对 ASD 相关基因网络的调控作用。
DEGs 和 DARs 与 ASD 相关基因及突触基因广泛富集：研究人员运用超几何富集分析评估 DEGs 和 DARs 与 ASD 数据集的重叠情况，发现它们在三个发育时间点均与高可信度的 ASD 基因富集。不仅神经元中的 DEGs 和 DARs 与 ASD 相关基因关联紧密，神经祖细胞（NPCs）中的 aRGs 和 IPs 也表现出显著富集。同时，DEGs 和 DARs 与突触相关基因也存在显著富集，即使在 NPCs 中也是如此，这进一步强调了 FOXP1 与突触基因的紧密联系。
潜在的 FOXP1 直接靶点：通过搜索富集的转录因子（TF）基序、整合 FOXP1 染色质免疫沉淀测序（ChIP - seq）数据以及联合 snRNA - seq/snATAC - seq 分析，研究人员发现迁移神经元中富集的基序数量最多，且在多个时间点和细胞类型中观察到 FOX 家族基序的富集。与先前研究的 ChIP - seq 数据重叠分析表明，相关基因功能涉及轴突发生、神经元分化、轴突导向和突触组装等。通过联合分析还确定了不同基因型间变化的基因，这些基因在不同时间点和细胞类型中参与了神经元分化、细胞黏附、神经发生等重要过程。
Foxp1 缺失导致 E13.5 时细胞发育轨迹更成熟：在 E13.5 时，FOXP1 在 NPCs 和有丝分裂后神经元中均有表达。研究人员通过伪时间分析发现，Foxp1 cKO 小鼠的细胞伪时间分布更为紧凑，所有 cKO 细胞类型的伪年龄值都比对照细胞更老，这表明 FOXP1 在早期神经发生中对细胞发育起到调控作用。
Foxp1 缺失改变基因表达，影响祖细胞维持和分化：对 aRGs 和深层神经元（DL neurons）中 DEGs/DARs 的功能富集分析显示，FOXP1 缺失会导致 aRGs 中促进分化的基因表达增加，从而使细胞伪年龄提前。同时，E13.5 时 cKO 小鼠的细胞类型比例发生显著变化，aRGs 数量减少，L5 - L6 神经元数量相对增加，这表明 FOXP1 缺失促进了神经元的分化。
Foxp1 cKOs 中染色质可及性异质性降低，表明细胞分裂年龄更年轻：利用 EpiTrace 工具对细胞年龄进行评估，发现 E13.5 时 Foxp1 cKO 小鼠的 aRGs 细胞复制年龄更年轻，这与之前观察到的细胞伪年龄增加和分化潜能提高的结果相吻合。
FOXP1 缺失导致祖细胞 S 期延长：研究人员使用两种胸腺嘧啶类似物 BrdU 和 EdU 来估计 E13.5 时 S 期的长度，发现 Foxp1 cKO 小鼠的 NPCs 中 S 期显著延长，细胞周期长度也相应增加。但在 M 期及细胞凋亡方面，cKO 小鼠与对照小鼠未发现显著差异，这表明 cKO 小鼠的祖细胞池改变主要是由于 aRGs 数量减少、S 期延长以及祖细胞维持所需基因的失调。
深层神经元的早熟生成：E13.5 时，Foxp1 cKO 小鼠的 TBR1 + 细胞层（深层神经元标记）相对较厚，但到 E16.5 时厚度减少。这可能是因为 E13.5 时 NPCs 中分化性分裂增加，导致深层神经元早熟生成，但同时也耗尽了祖细胞池，进而导致出生后神经元产生总体减少。
E15.5 - E16.5 期间，Foxp1 缺失导致细胞周期退出加速：研究人员在 E15.5 注射 EdU，并在 24 小时后分析细胞周期退出情况，发现 cKO 小鼠中退出细胞周期的细胞比例更高，这表明 NPCs 更快地退出细胞周期，倾向于产生神经元，而牺牲了自我更新分裂。这一现象可能是导致 P7 时 Foxp1 cKO 小鼠 L2 - L4 相对较厚，而整个新皮质较薄的原因之一，同时也与 E16.5 时 L2 - L4 神经元的生成加速以及祖细胞池的耗尽有关。
FOXP1 缺失导致神经元迁移缺陷：通过 EdU 脉冲标记实验，研究人员发现 E15.5 产生的神经元在 P7 和 P16.5 时，在 Foxp1 cKO 小鼠的深层（DLs）中存在更多 EdU + CUX1 + 细胞，这表明上层（UL）神经元在生成后无法迁移到预期位置，存在迁移缺陷，而非细胞命运指定的改变。此外，E16.5 和 P0.5 的 DEGs 和 DARs 也显示出与神经元迁移相关基因的功能异常，进一步支持了迁移缺陷的结论。
讨论
上层神经元的选择性迁移缺陷：本研究通过胸腺嘧啶类似物脉冲标记神经元的方法，明确区分了迁移障碍和细胞命运指定表型。利用单细胞基因组学技术，研究人员还对每个时间点的细胞进行了无偏基因组分析。例如，在 P0.5 时，L2 - L4 神经元中的 Rorb 基因表达下调且染色质可及性降低，而 RORB 突变与 ID 和癫痫相关，这表明 FOXP1 与 RORB 之间可能存在与癫痫易感性相关的联系。
FOXP1 对 ASD 相关基因的调控：FOXP1 是高可信度的 ASD 相关基因，本研究强调了在所有时间点 DEGs 和 DARs 与 ASD 基因的富集增加。鉴于 ASD 遗传突变和分子机制的异质性，理解 ASD 相关基因的收敛机制十分重要。本研究中观察到的 FOXP1 缺失导致的分子功能和神经元生成变化，有助于深入了解其他 ASD 风险基因模型中上层神经元的共同变化。
FOXP1 对突触蛋白编码基因的调控：研究发现，cKO 小鼠中的 DEGs 和 DARs 在发育过程中均富集突触蛋白编码基因，尤其是在出生后组织中。这表明 FOXP1 可能参与调节新皮质发育过程中的微电路和宏电路，并且其在调节兴奋性皮质神经元的钾电流方面可能发挥类似作用。
结论
本研究在细胞分辨率下揭示了 FOXP1 在早期新皮质发育中的体内作用。FOXP1 对 NPCs 的功能至关重要，它通过改变 NPCs 的增殖间接影响神经发生速率，同时直接影响皮质神经元的迁移。研究还鉴定出 Foxp1 cKO 小鼠中与 ASD 和突触蛋白编码基因富集的 DEGs 和 DARs，这些可能是细胞类型特异性表型的潜在机制。此外，对 snRNA - seq 和 snATAC - seq 结果的分析也为细胞成熟提供了补充信息。这些发现为细胞和分子操作以挽救与 FOXP1 综合征和其他形式的 ASD 相关的表型提供了机会。
研究局限性
本研究仅选取了早期新皮质发育的部分时间点进行研究，虽然这些时间点是基于 FOXP1 的表达模式和出生后 ASD 相关表型选择的，但神经发育在小鼠大脑中迅速发生，因此本研究仅提供了早期和晚期神经发生以及 P0.5 时 FOXP1 层特异性表达的部分信息。此外，snRNA - seq 技术会丢失空间信息，无法确定迁移缺陷神经元中的基因表达变化。本研究主要聚焦于 Emx1.Cre 驱动的兴奋性神经元谱系中 Foxp1 条件性缺失的影响，而 FOXP1 在其他细胞类型中也有表达，这些细胞可能受到非细胞自主效应的影响，因此对这些细胞类型的研究还需进一步深入。未来的研究可以探索更多时间点，采用空间保留方法，以更全面地了解 FOXP1 对新皮质发育的调控作用。同时，使用 FOXP1 综合征相关的单倍体不足小鼠模型可能会揭示更多或不同的下游通路。
