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为解决 FAME 生产问题，研究人员构建生物膜催化平台，实现连续催化，意义重大。
脂肪酸甲酯（FAME）是一种重要的有机化合物，由长链脂肪酸与甲醇相互作用合成。这种化合物具有诸多显著的环境效益，包括能耗和排放低、原料来源广泛、可再生、生物降解性优良，并且在应用过程中对环境污染极小。FAME 燃烧释放的二氧化碳被视为碳中性，有助于减少温室气体排放。传统的酸碱催化可使甲醇与植物油、动物脂肪或废弃食用油等原料发生酯化反应，生成 FAME 和甘油。该方法成本效益高，但存在催化剂回收困难和废水处理等问题。相比之下，酶催化（如使用脂肪酶）具有显著优势：反应条件温和、选择性高且环境友好，是一种更具可持续性的生产方法。脂肪酶能够高效催化 FAME 合成，主要来源于细菌、酵母和真菌等微生物。这些酶具有高底物特异性和催化效率，可在温和的反应条件下进行合成。尽管如此，成本高和反应速率慢等挑战依然存在，而且传统的酶固定化方法往往忽视环境因素。因此，更全面、合理地优化脂肪酶的使用对于应对这些挑战至关重要。
近年来，新型可持续材料不断涌现，相比传统化学材料具有独特优势。这种材料通过将天然生物膜与合成生物学技术相结合，构建出小型化的功能性生物膜系统。在酶固定化领域，生物膜作为一种材料，不仅能增强酶的催化能力和稳定性，还简化了酶的再生过程，可将其视为 “活性材料” 。目前，生物膜表面展示的研究和应用正在迅速发展。深入探究生物膜的作用机制和组装模式，将极大地有利于其在生物催化、生物医学和环境保护等领域的应用。然而，由于生物膜形成机制和组装能力的限制，通过合成生物学构建的生物膜表面展示系统主要局限于大肠杆菌。因此，揭示不同细菌生物膜的形成机制和自组装结构，对于推进生物膜表面展示工程以及扩充合成生物学可用的工具库至关重要。
枯草芽孢杆菌（B. subtilis）是一种典型的革兰氏阳性菌，拥有丰富的遗传和分子工具，便于对其代谢途径进行探索和调控。这种细菌在众多工业应用中发挥着重要作用，从水解酶生产、食品发酵到近年来的益生菌制造。随着对生物膜结构研究的不断深入，已鉴定出两种关键的结构蛋白 TasA 和 BslA，可用于枯草芽孢杆菌中异源蛋白的表面展示。聚焦于 tapA-sipW-tasA 操纵子，研究发现淀粉样纤维 TasA 的形成受该操纵子调控，这对于维持生物膜的结构完整性至关重要，并且 TasA 在生物膜基质中含量丰富。TapA 被证实是 TasA 的组装和锚定蛋白，在淀粉样纤维 TasA 的折叠及其与细胞壁的附着过程中发挥关键作用。而 SipW 是一种 I 型信号肽酶，负责协调 TasA 和 TapA 向细胞外空间的分泌，促进其 N 端信号肽的翻译后修饰。
近年来，随着 “SpyTag/SpyCatcher” 系统的发现，多酶催化在各个领域受到广泛关注。通过 SpyTag/SpyCatcher 的双组分共价偶联技术，可将酶固定在生物膜表面，从而提高酶的稳定性。基于合成生物学技术，不同功能可通过柔性接头与 TasA 蛋白融合。TasA 蛋白能够在生物膜表面展示，同时保持酶的结构和功能完整性。通过上述两种方法获得的功能化枯草芽孢杆菌生物膜表面展示平台，与物理载体材料相结合，形成可回收和可编辑的活性载体材料。
在本研究中，为构建绿色可持续的催化平台，研究人员以生物膜作为固定化酶的活性载体，通过过表达 TasA 来提高生物膜的形成能力。成功构建 “SpyTag/SpyCatcher” 系统，使 LipA 与 TasA 融合表达，LipA 在生物膜中形成可编辑的活性载体材料。最终，利用这种可连续催化且能恢复到较高酶活性的活性材料合成 FAME。
基因、菌株和质粒：原始野生型菌株枯草芽孢杆菌 168 购自中国武汉淼灵生物技术有限公司。构建了同时敲除tasA和sinR基因的新重组菌株 168ΔtasAΔsinR（168ΔΔ）作为底盘菌株。本研究中使用的所有基因、菌株和质粒均列于表 1。
在塑料上形成生物膜及在培养基中的正常生长：培养基成分，LB 培养基（胰蛋白胨 10 g/L-1、酵母提取物 5 g/L-1、氯化钠 10 g/L-1）。培养枯草芽孢杆菌所用抗生素的使用浓度如下。
功能蛋白表达验证：根据先前报道，研究人员发现 tapA-sipW-tasA 操纵子的表达受sinR抑制，sinR基因的敲低促进了 TapA 锚定蛋白和淀粉样纤维 TasA 的过表达。因此，研究人员使用 168ΔΔ（不含tasA和sinR的 168 菌株）作为生物膜展示平台的底盘细胞，并使用 PtasA、PtasASpyTag 和 PtasAlipA 蛋白构建新型重组菌株 168ΔΔ-PtasA、168ΔΔ-PtasASpyTag 和 168ΔΔ-PtasAlipA。研究人员进行了一系列实验。
结论：总之，为解决工业中 FAME 生产的绿色、高效和可持续性问题，研究人员以淀粉样纤维 TasA 为载体，增强生物膜形成能力，构建了具有脂肪酶活性的功能载体材料。研究人员比较了 SpyTag/SpyCatcher 双组分共价生物偶联和融合蛋白直接锚定 LipA 的催化效果。利用功能可编辑的生物材料实现了连续催化和酶活性的相关研究。
作者贡献声明：任佩芳：撰写 - 审阅与编辑、撰写 - 初稿、验证、形式分析。赵伟：撰写 - 初稿、方法学、数据整理。周超伟：验证、调查。陈天鹏：监督、数据整理。孙文君：撰写 - 审阅与编辑、验证、监督、方法学、资金获取、形式分析。陈勇：撰写 - 审阅与编辑、项目管理、调查、资金获取、概念构思。
利益冲突声明：作者声明他们不存在已知的可能影响本文所报道工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢：本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFC2105400）；国家自然科学基金（22178176；22208157）；江苏国家先进生物制造协同创新中心（XTA2201）；宁夏回族自治区重点研发项目（2023BEE01011）；材料化学工程国家重点实验室（SKL-MCE-22A04）；2024 年江苏省优秀博士后计划；自然科学等项目的支持。
