新型比率电化学适配体传感器：精准检测金黄色葡萄球菌的创新利器

来自中国的研究人员为解决食源性细菌检测难题，开发比率电化学适配体传感器检测金黄色葡萄球菌，意义重大。

　　全球食源性细菌病原体高发问题持续威胁着人类健康和公共卫生安全。准确测定食源性细菌，对有效防控相关疾病至关重要。传统检测技术，如基于培养的计数法、酶联免疫吸附测定法（ELISA）和聚合酶链反应（PCR），在速度、成本和核酸提取操作复杂性方面存在局限。生物传感器虽能解决部分不足，但传统基于单信号输出的电化学（EC）平台，仍易受环境干扰，出现假阳性结果。近期，比率电化学 EC 生物传感器取得进展，其利用信号探针（SP）和内参比探针（IR）进行双信号校正，显著提高了可靠性。目前，比率电化学 EC 生物传感器主要有两类：一类是利用纳米材料或核酸将内参比探针固定在电极表面；另一类是将内参比探针添加到电解质检测溶液中。然而，大多数比率电化学 EC 系统仍依赖复杂的探针标记技术，且未与高效信号放大策略相结合。

适配体（Apt）稳定性高、成本低、易于修饰，已成为全细胞细菌识别中替代抗体的优质选择。适配体无需细菌培养和核酸提取等复杂步骤，是即时检测（POCT）平台出色的识别元件。金属有机框架（MOF）是一类有机 - 无机杂化材料，由有机配体与金属离子或簇通过配位键自组装而成。这类材料的多孔结构、大表面积和可调节的结构功能，使其在分析领域得到广泛应用。制备基于金属有机框架的电化学 EC 生物传感器的常规方法，通常涉及标记电化学活性分子，如亚甲基蓝和血红素。虽然这些标记分子能增强信号，但复杂的制备过程难以避免。相比之下，像 CuMOF 这样的自报告金属有机框架，为无标记电化学 EC 检测提供了固有电活性，无需复杂的探针标记程序。不过，其在比率系统中的应用，尚未得到充分探索。

受生物分子马达启发，基于 DNA 的纳米机器已在多个领域得到应用。其中，三维（3D）DNA 纳米机器作为高动态设备，在生物传感领域表现突出，具有工作效率高、信号放大能力强等优势。DNA 步行机器是三维 DNA 纳米机器的一个关键子类，它利用可编程的步行者 DNA 链，在 DNA 折纸或纳米颗粒表面等界面上定向移动。这些系统可由酶促或无酶机制驱动。核酸外切酶 III（Exo III）能通过顺序水解磷酸二酯键，选择性地从平端或凹陷的 3' 端切割双链 DNA（dsDNA），是三维 DNA 步行机器理想的酶促驱动剂。与序列依赖性核酸酶不同，核酸外切酶 III 无需特定识别位点即可发挥作用，在多种 DNA 纳米结构中具有普遍适用性。这一独特特性，加上其连续性切割活性，使核酸外切酶 III 能高效循环利用 DNA 分子，放大检测信号，解决了分析灵敏度方面的关键难题。

在此，研究人员提出了一种新型比率电化学适配体传感器，它集成了磁性三维 DNA 步行机器和逐层（LBL）自组装金属有机框架标记，用于灵敏、准确地检测金黄色葡萄球菌（S. aureus）。自报告的 NH₂-MIL - 88 被用作信号探针，[Fe (CN)₆]^3-/4-作为内参比探针。随着目标细菌浓度的增加，信号探针的电流强度（I_SP）上升，内参比探针的电流强度（I_IR）下降。通过 I_SP与 I_IR的比值实现定量检测。该研究首次将酶促 DNA 步行器、金属有机框架的逐层自组装、金属有机框架的固有电活性和比率信号校正协同应用于细菌生物传感，解决了传统方法的关键局限。该平台有四大创新点：第一，在核酸外切酶 III 的驱动下，系统实现了目标触发的 DNA 循环，并通过磁分离减少背景干扰，提高了复杂样品检测的特异性；第二，具有独特氧化还原峰的自报告 NH₂-MIL - 88 金属有机框架作为信号探针，无需额外的电活性标记；第三，通过磁性三维 DNA 机器和金属有机框架的逐层组装实现级联信号放大，能够灵敏地检测细菌；第四，NH₂-MIL - 88（信号探针）与 [Fe (CN)₆]^3-/4-氧化还原对（内参比探针）之间的电流比，可自动校正环境和操作差异，克服了单信号适配体传感器的重现性难题。这种模块化设计，通过更换适配体，可适用于其他病原体检测，为构建通用的即时检测平台奠定了基础。

材料和仪器

本实验中使用的所有寡核苷酸均购自上海生工生物工程股份有限公司，具体序列如下：

• 金黄色葡萄球菌适配体（Apt）：5′ - GCAATGGTACGGTACTTCCUCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA - 3'。
• 步行者 DNA：5′ - AAGTAGCGTGCACTTTTGACACACTA - 3'。
• 生物素修饰的发夹探针（Bio - HP）：5′ - CTTCTTCGTGCACTTTTGCTCAFTCAAAAGTGCACGCTACTT - 3'。
• 巯基修饰的连接探针 1（SH - LP1）：5′ - AAAGTGCACGAAGAAG - 3'。

比率电化学细菌适配体传感器的原理

在本研究中，研究人员开发了一种利用三维 DNA 步行机器和金属有机框架自组装的比率电化学生物传感器，用于灵敏测定金黄色葡萄球菌。步行者 DNA 被设计为与适配体部分互补，其 3' 端存在错配碱基，以降低步行者 / 适配体复合物的稳定性，从而增加金黄色葡萄球菌与适配体相互作用的可及性。在金黄色葡萄球菌存在的情况下，它会与步行者 DNA 竞争结合适配体，导致二者解离。

结论

在本研究中，研究人员报告了一种比率电化学传感平台的开发，该平台利用目标触发的磁性三维步行机器的级联信号放大和自报告金属有机框架的自组装，对金黄色葡萄球菌进行灵敏分析。酶促 DNA 步行器、磁分离、金属有机框架的逐层自组装、金属有机框架的固有电活性和比率信号校正的协同整合，共同促成了该平台卓越的分析性能。

作者贡献声明

孟贤竹：撰写初稿、软件、调查、形式分析、数据整理。马睿：撰写初稿、调查。罗霄：验证、软件、形式分析。刘洋：形式分析、数据整理。尹小丽：验证、软件。顾慧文：验证、软件。陈莹：撰写 - 评审与编辑、监督、资源、项目管理、方法学、资金获取。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了湖北省自然科学基金（编号：2023AFB906）和国家自然科学基金（编号：21605007）的资助。