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来自多方的研究人员为解决病原体检测难题，开展微流控芯片滚环扩增（RCA）研究，实现高敏检测，助力即时检测（PoC）。
在应对如 COVID-19 这样的病毒爆发以及日益严峻的抗生素耐药菌威胁时，快速且分散式的病原体检测至关重要。抗生素耐药性（AMR）被视为一个 “同一健康” 问题，2019 年在全球范围内导致了超过 100 万人死亡，预计到 2050 年这一数字将达到 1000 万。典型的耐药菌有革兰氏阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和革兰氏阴性的耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）。早期检测有助于控制传染源和传播途径，因此精确的诊断工具对全球健康至关重要。
在分子诊断领域，聚合酶链式反应（PCR）是中央实验室中最常用的 DNA 扩增技术。尽管先进的 PCR 变体已证明其特异性和敏感性，但它通常需要大量的样本制备和纯化步骤，还需要庞大的热循环仪来控制温度。获取结果往往需要 1 - 5 天，紧急情况下也需要半天时间。PCR 在微流控设备中也很受欢迎，可用于精确识别特定病原体或疾病的 DNA 序列特征。用于 PCR 的微流控设备可分为静态 / 反应型和流动型。静态 / 反应型通过对反应腔内的试剂进行热循环来实现扩增；流动型则是让样本经过 PCR 循环所需的不同温度区域，或者将溶液在不同温度的反应器之间泵送。近年来，黄等人开发了基于微流控芯片的 PCR 阵列系统，可在 1.5 小时内检测 21 种病原体，检测限为 103 拷贝 /mL。洪等人采用在固相进行 PCR，并结合嵌入微芯片的超临界角荧光微透镜阵列进行信号检测的策略，发现该微流控芯片（LOC）系统的检测限为 0.8 个荧光团 /μm2，固相 PCR 对肠炎沙门氏菌 DNA 模板的敏感性低至 1.6 拷贝 /μL。近年来，数字滴液 PCR 也应用于微流控领域，提高了检测灵敏度。商用的微流控芯片（LoC）设备，如 GeneXpert systems?（赛沛公司），已采用基于 PCR 的检测技术并投入市场。这些系统虽被认为适用于即时检测（PoC），但仍需要庞大的设备来进行设备控制（温度、流体移动、信号采集等），而且大多数情况下，部分实验步骤仍需技术人员在芯片外完成。与等温技术相比，所有基于 PCR 的方法都需要在 50 - 95°C 左右进行多次加热 - 冷却循环，这使得其集成更加困难。
为简化核酸扩增检测（NAAT）在芯片上的集成，等温核酸扩增技术应运而生，如环介导等温扩增（LAMP）或滚环扩增（RCA）。由于等温扩增可避免复杂的温度曲线问题，在即时检测（PoC）应用中受到越来越多的关注。RCA 可在室温至 37°C 的相对较低温度下扩增核酸，其基于细菌和病毒中的滚环复制机制。在基于锁式探针的滚环扩增技术（PLP - RCA）中，实验需要线性 DNA 锁式探针（PLP）模板、短 DNA 或 RNA 引物 / 靶标、连接酶以及具有强置换活性的 DNA 聚合酶来启动反应。扩增会产生一条长单链分子，其中包含数千个与原始环状 DNA 相连的环状模板重复拷贝。虽然这种线性扩增过程已具备高灵敏度，但还可通过其他 RCA 变体（如超支化 RCA、多引物 RCA 或环到环扩增（C2CA））实现指数扩增，进一步提高灵敏度。作为将 RCA 集成到微流控设备中的具体实例，佐藤等人报道了在微流控中使用珠子作为固相支持物，捕获肠炎沙门氏菌的靶 DNA 进行 PLP 和 RCA 扩增。芯片上的扩增耗时 3.5 小时，可成功检测到 88 ng 的沙门氏菌基因组 DNA（30 amol）。尽管有研究在芯片上实施 RCA，但只有少数研究聚焦于直接检测双链基因组 DNA，且没有完全解决连接、扩增和检测过程的集成问题。
这项研究展示了一种基于微流控芯片的连续流动 RCA 模块，该模块采用固相捕获技术，可特异性检测 DNA 分子。该系统可在显微镜下观察到滚环扩增产物（RCPs），并与微型氢化非晶硅（a - Si:H）p - i - n 光电二极管相结合，证明了其在即时检测（PoC）中的便携性。研究人员还采用质量平衡方法来表征芯片上靶 DNA 的捕获和扩增效率。他们探索了多种分子策略，旨在通过捕获靶 DNA（尤其是双链 DNA），直接从病原体的目标 DNA 序列中检测靶序列，且无需标记，可直接从细菌样本中进行检测。生物素化的 DNA 作为 RCA 引物，与 PLP 的主链杂交。该研究证明了将集成模块与微流控芯片（LoC）设备结合使用的可行性，实现了从实际样本到检测结果的分析，证明其与即时检测（PoC）应用兼容。
微流控设备的设计、制造和操作：微流控设备采用标准光刻和软光刻技术制造，详细内容在其他地方有描述，也在补充信息第 1 节中有详细说明。最终的聚二甲基硅氧烷（PDMS）设备有一个 100μm 的腔室用于填充珠子，还有一个高度为 20μm 的交叉通道用于溶液流动，并与一块 PDMS 平板不可逆密封。使用的是赛默飞世尔科技公司的 Pierce 链霉亲和素琼脂糖（链霉亲和素）珠子，平均……
芯片上使用生物素标记的单链靶 DNA 进行滚环扩增：概念验证和模型策略优化：采用实验设计（DoE）方法对基于固相固定策略的芯片上 RCA 进行优化。部分因子设计测试了七个变量：（1）PLP 浓度，（2）T4 DNA 连接酶浓度，（3）dNTP 浓度，（4）Phi29 DNA 聚合酶浓度，（5）溶解氧（DO）浓度，（6）流速，（7）扩增时间。半正态图表明，PLP 浓度对 RCP 荧光强度影响最大。
结论：在这项研究中，研究人员成功地在微流控芯片上实现了 RCA，并采用集成固相捕获方法，对其进行了系统优化，以提高灵敏度和特异性。通过实验设计（DoE）优化的模型策略，研究人员在 2 小时内实现了从样本到结果的检测，可检测到 0.4 fM 的靶单链 DNA。该系统与通过 a - Si:H p - i - n 光电二极管进行的芯片上荧光读数相结合，证明了其与即时检测（PoC）应用的兼容性。
作者贡献声明：卡塔琳娜?R?F?卡内拉：撰写 - 审核与编辑、撰写 - 初稿、验证、方法学、调查、形式分析、数据整理、概念化；拉斐拉?R?罗莎：撰写 - 审核与编辑、验证、方法学、调查、形式分析；弗吉尼亚?朱：撰写 - 审核与编辑、监督、项目管理、资金获取； Mats Nilsson：撰写 - 审核与编辑、项目管理、资金获取；纳拉亚南?马达博西：撰写 - 审核……
利益冲突声明：作者声明他们没有已知的可能影响本文所报道工作的财务利益或个人关系。
致谢：这项工作得到了葡萄牙科学技术基金会（FCT）的支持，资助了研究项目 VineSense（PTDC/BAA - DIG/4735/2020）和 ILSurvive（PTDC/EMD - TLM/3253/2020），以及通过基础和项目资助的 INESC MN 研究单位（UID/05367/2020）。作者感谢葡萄牙科学技术基金会（FCT）通过博士奖学金资助卡塔琳娜?R?F?卡内拉（PD/BD/135274/2017）。瑞典研究理事会（VR 2019 - 01238）和克努特和爱丽丝?瓦伦堡基金会也……
